Νέα

Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Τα καρκινικά κύτταρα έχουν εξελίξει διάφορους μηχανισμούς για να ξεπεράσουν το κυτταρικό στρες και να συνεχίσουν να προοδεύουν.Η πρωτεϊνική κινάση R (PKR) και ο πρωτεϊνικός ενεργοποιητής της (PACT) είναι οι αρχικοί ανταποκριτές που παρακολουθούν διάφορα σήματα στρες που οδηγούν σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης.Ωστόσο, η ρύθμιση της οδού PACT-PKR στα καρκινικά κύτταρα παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.Εδώ, ανακαλύψαμε ότι το αντιπληροφοριακό RNA 1 (DARS-AS1) της μακράς μη κωδικοποίησης RNA (lncRNA) aspartyl tRNA συνθετάσης εμπλέκεται άμεσα στην αναστολή της οδού PACT-PKR και προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων.Χρησιμοποιώντας μεγάλης κλίμακας λειτουργικό έλεγχο του lncRNA που σχετίζεται με τον καρκίνο CRISPRi 971, διαπιστώσαμε ότι το DARS-AS1 συσχετίστηκε με σημαντικά ενισχυμένο πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων.Επομένως, το νοκ-άουτ DARS-AS1 αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και προάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές in vitro και μειώνει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου in vivo.Μηχανικά, το DARS-AS1 συνδέεται απευθείας με τον τομέα ενεργοποίησης PACT και αποτρέπει την αλληλεπίδραση PACT-PKR, μειώνοντας έτσι την ενεργοποίηση PKR, τη φωσφορυλίωση eIF2α και αναστέλλοντας τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.Κλινικά, το DARS-AS1 εκφράζεται ευρέως σε πολλαπλούς καρκίνους και η υπερέκφραση αυτού του lncRNA είναι ενδεικτική κακής πρόγνωσης.Αυτή η μελέτη διευκρινίζει την ειδική για τον καρκίνο ρύθμιση της οδού PACT-PKR από το DARS-AS1 lncRNA και παρέχει έναν άλλο στόχο για την πρόγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου.
Η ικανότητα προσαρμογής στο στρες είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της επιβίωσης και του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων.Ο γρήγορος πολλαπλασιασμός και τα μεταβολικά χαρακτηριστικά του καρκίνου κορυφώνονται σε σκληρά μικροπεριβάλλοντα - στέρηση θρεπτικών ουσιών, υποξία και χαμηλό pH - που μπορούν να πυροδοτήσουν τις οδούς σηματοδότησης του κυτταρικού θανάτου.Η απορρύθμιση των ευαίσθητων στο στρες γονιδίων όπως το p535, οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ 6, 7, KRAS8, 9 και HIF-110, 11, 12, 13 παρατηρείται συχνά στον καρκίνο, εμποδίζοντας έτσι την απόπτωση και προάγοντας την επιβίωση.
Η πρωτεϊνική κινάση R (PKR) είναι ένας σημαντικός αισθητήρας στρες και κινάση υπομονάδας του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης 2α (eIF2α), ενός μεταφραστικού ρυθμιστή που συνδέει το κυτταρικό στρες με τον κυτταρικό θάνατο.Η PKR αναγνωρίστηκε αρχικά ως αντιική πρωτεΐνη με την ανίχνευση ενός ξένου δίκλωνου RNA (dsRNA).Κατά την ενεργοποίηση, η PKR φωσφορυλιώνει το eIF2α για να αναστείλει την ιική και κυτταρική πρωτεϊνική σύνθεση14,15,16.Η PACT (πρωτεΐνη ενεργοποιητή PKR) έχει ταυτοποιηθεί ως η πρώτη πρωτεΐνη ενεργοποιητή PKR απουσία dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης με το PKR, το PACT μετατρέπει διάφορες πιέσεις (ασιτία ορού, επεξεργασία υπεροξειδίου ή αρσενίτη) στην PKR και στα κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης.Εκτός από τη φωσφορυλίωση eIF2α, η ενεργοποίηση PKR με τη μεσολάβηση PACT πυροδοτεί διάφορα συμβάντα που σχετίζονται με την απόκριση στο στρες, συμπεριλαμβανομένης της αλλοιωμένης κατάστασης οξειδοαναγωγής μέσω της οδού PI3K/Akt24, του ενισχυμένου ελέγχου της βλάβης του DNA μέσω του p5325,26 και του NF-κB27,28 Ρυθμίζει τη μεταγραφή, 29. Δεδομένου του κρίσιμου ρόλου τους στην απόκριση στο στρες, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και άλλες βασικές κυτταρικές διεργασίες, το PKR και το PACT αποτελούν πολλά υποσχόμενους θεραπευτικούς στόχους για πολλές ασθένειες, ιδιαίτερα τον καρκίνο30,31,32,33.Ωστόσο, παρά αυτή την πλειοτροπική λειτουργική και βιολογική σημασία, η ρύθμιση της δραστικότητας PACT/PKR στα καρκινικά κύτταρα παραμένει αδιευκρίνιστη.
Τα lncRNA είναι μεταγραφές μεγαλύτερες από 200 νουκλεοτίδια χωρίς δυνατότητα κωδικοποίησης πρωτεΐνης.Δεδομένου ότι τα έργα αιχμής για την αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος έχουν εντοπίσει χιλιάδες lncRNAs, 35,36 έχει γίνει μεγάλη προσπάθεια για να διαλευκανθούν οι βιολογικές τους λειτουργίες.Ένας αυξανόμενος όγκος ερευνών έχει δείξει ότι τα lncRNA εμπλέκονται σε πολλές βιολογικές διεργασίες37 συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης της αδρανοποίησης των χρωμοσωμάτων Χ38,39, της αποτύπωσης40, της μεταγραφής41,42, της μετάφρασης43, ακόμη και της ανάπτυξης καρκίνου44,45,46,47.Αυτές οι μελέτες ανέφεραν ότι πολλά lncRNA εμπλέκονται στην οδό PACT/PKR.Μια τέτοια μελέτη έδειξε ότι το lncRNA ASPACT ανέστειλε τη μεταγραφή PACT και αύξησε την πυρηνική κατακράτηση του PACT mRNA.Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι το lncRNA nc886 συνδέεται με το PKR και αναστέλλει τη φωσφορυλίωση του49,50.Μέχρι στιγμής, το lncRNA που ρυθμίζει την ενεργοποίηση PKR με τη μεσολάβηση PACT δεν έχει αναφερθεί.
Το αντιπληροφοριακό RNA 1 (DARS-AS1) συνθετάσης ασπαρτύλ-tRNA έχει ταυτοποιηθεί ως ογκογόνο lncRNA51,52,53,54.Μέσω της ρύθμισης των miP-194-5p53, miP-12952 και miP-532-3p51, το DARS-AS1 έχει αποδειχθεί ότι προάγει την ανάπτυξη καρκινώματος διαυγών νεφρικών κυττάρων, καρκινώματος θυρεοειδούς και μη μικροκυτταρικού καρκινώματος πνεύμονα, αντίστοιχα.Ο Tong και οι συνεργάτες του βρήκαν επίσης ότι το DARS-AS1 προάγει την εξέλιξη του μυελώματος διατηρώντας τη σταθερότητα του μοτίβου δέσμευσης RNA πρωτεΐνης 39 (RBM39).Ωστόσο, δεν έχουν διεξαχθεί μελέτες σχετικά με το εάν αυτό το lncRNA εμπλέκεται στη ρύθμιση της ενεργοποίησης του PACT-PKR και στην απόκριση στρες των καρκινικών κυττάρων.
Εδώ, πραγματοποιήσαμε μια μεγάλης κλίμακας διαλογή απώλειας λειτουργίας χρησιμοποιώντας το σύστημα CRISPRi και προσδιορίσαμε ότι το DARS-AS1 lncRNA προάγει τον πολλαπλασιασμό πολλών τύπων καρκινικών κυττάρων.Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει έναν σημαντικό μηχανισμό: το DARS-AS1 συνδέεται απευθείας με το PACT, αναστέλλει τη δέσμευση PACT και PKR, αποτρέπει τη φωσφορυλίωση του eIF2α, ενός υποστρώματος χαμηλότερης PKR, και τελικά αναστέλλει τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.Συμπερασματικά, η εργασία μας αποκαλύπτει το DARS-AS1 lncRNA ως ρυθμιστή της οδού PACT-PKR και έναν πιθανό στόχο για τη θεραπεία και την πρόγνωση του καρκίνου.
Εκτεταμένες μελέτες γονιδιωματικού προφίλ έχουν εντοπίσει εκατοντάδες lncRNA που σχετίζονται με τον καρκίνο.Ωστόσο, η λειτουργία τους παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη56.Για τον εντοπισμό υποσχόμενων υποψηφίων lncRNA που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου, πραγματοποιήσαμε μια εξέταση απώλειας λειτουργίας για μειωμένο πολλαπλασιασμό στην κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου SW620 χρησιμοποιώντας το σύστημα CRISPRi (Εικ. 1α).Το μοναδικό χαρακτηριστικό των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του παχέος εντέρου SW480 και SW620 είναι ότι προέρχονται από πρωτογενείς και δευτερογενείς όγκους σε έναν μόνο ασθενή.Αυτό παρέχει μια πολύτιμη σύγκριση για τη μελέτη γενετικών αλλαγών στην εξέλιξη του προχωρημένου καρκίνου του παχέος εντέρου.Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τα μεταγραφώματα των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του παχέος εντέρου (SW480 και SW620) χρησιμοποιώντας αλληλουχία RNA και συλλέξαμε ορισμένα πιθανά λειτουργικά lncRNA από τη δημοσιευμένη βιβλιογραφία.Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, σχεδιάσαμε μια συγκεντρωτική βιβλιοθήκη sgRNA που περιέχει 7355 ολίγο sgRNA που στοχεύουν 971 συνδεδεμένα με καρκίνο lncRNAs και 500 μη στοχευμένα ολίγο sgRNA για αρνητικό έλεγχο (Συμπληρωματικά δεδομένα 1).
Σχηματική αναπαράσταση διαλογής με χρήση του συστήματος CRISPRi.b εμπλουτισμός sgRNA μετά από διαλογή.Η οριζόντια διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει το log2 (αλλαγή διπλώματος) = ±0,58.Η κάθετη διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει τιμή p = 0,05.Οι μαύρες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν το μη-στόχο sgRNA (που ορίζεται ως NC).Οι κόκκινες κουκκίδες είναι sgRNA που στοχεύουν το DARS-AS1.Οι μπλε κουκκίδες είναι sgRNA που στοχεύουν το LINC00205, ένα ογκογόνο lncRNA που περιγράφηκε προηγουμένως.αλλαγή αναδίπλωσης = (κανονικοποιημένη ανάγνωση, ημέρα 17)/(κανονικοποιημένη ανάγνωση, ημέρα 0).c Η αναστολή του sgRNA του DARS-AS1 ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη.Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± τυπική απόκλιση των τριών πειραμάτων.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 t-test Student δύο ουρών.d Έκφραση DARS-AS1 σε όγκους (σύνολο δεδομένων TCGA).em Έκφραση του DARS-AS1 σε ζευγαρωμένα δείγματα φυσιολογικού και όγκου από ασθενείς με BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP και COAD, αντίστοιχα (σύνολο δεδομένων TCGA).Οι τιμές p λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ t-test Student με δύο ουρές.
Μετά την κατασκευή του πλασμιδίου και τη συσκευασία του φακοϊού, μετατρέψαμε την κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου dCas9-SW620 με την παραπάνω βιβλιοθήκη σε τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα μόλυνσης.Η πολλαπλότητα μόλυνσης (MOI) για αυτές τις λοιμώξεις ήταν 0,1-0,3, υποδεικνύοντας ότι κάθε κύτταρο μπορεί να επιμολυνθεί μόνο με ένα sgRNA.Μετά από 18 ημέρες καλλιέργειας in vitro, το προφίλ εμπλουτισμού των sgRNA-στόχων μειώθηκε ή αυξήθηκε μετά τη διαλογή, ενώ ο αριθμός των μη στοχευμένων ολιγονουκλεοτιδίων ελέγχου παρέμεινε σχετικά αμετάβλητος σε σύγκριση με το προφίλ προ-διαλογής, υποδεικνύοντας ότι ο στόχος μας έχει ένα εξαιρετικά ειδικό για την εξέταση βιβλιοθήκη.Ρύζι.1β και συμπληρωματικός πίνακας 1). Το LINC00205, το οποίο αναφέρθηκε προηγουμένως ότι προάγει την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα και του καρκίνου του ήπατος58,59,60, ελέγχθηκε (log2 (αναδίπλωση) < -0,58, τιμή p < 0,05), επιβεβαιώνοντας την αξιοπιστία αυτής της εξέτασης (Εικ. 1β). Το LINC00205, το οποίο αναφέρθηκε προηγουμένως ότι προάγει την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα και του καρκίνου του ήπατος58,59,60, ελέγχθηκε (log2 (αναδίπλωση) < -0,58, τιμή p < 0,05), επιβεβαιώνοντας την αξιοπιστία αυτής της εξέτασης (Εικ. 1β). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию εύπιστο χέρι legkih και χέρι печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное исменение) <-0,58, πλεονέκτημα (5, σημαδεία) <0, 1β). Το LINC00205, που προηγουμένως είχε αναφερθεί ότι προάγει την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα και του καρκίνου του ήπατος58,59,60, εξαιρέθηκε (log2 (πλάσια αλλαγή) <-0,58, τιμή p <0,05), επιβεβαιώνοντας την ανθεκτικότητα αυτής της εξέτασης (Εικ. .1β) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию надеж за рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное скринение) <-0,58, p-значение <0, 1β). Το LINC00205, που είχε αναφερθεί προηγουμένως ότι προάγει την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα και του ήπατος58,59,60, αποκλείστηκε (log2 (πλάσια αλλαγή) <-0,58, τιμή p <0,05), επιβεβαιώνοντας την ευρωστία αυτής της εξέτασης (Εικ. .1b).
Μεταξύ όλων των lncRNA που δοκιμάστηκαν, το DARS-AS1 εξετάστηκε επίσης, με τα τρία συγγενή ολιγονουκλεοτίδια sgRNA να μειώνονται σημαντικά μετά από 18 ημέρες καλλιέργειας, υποδηλώνοντας ότι η καταστροφή αυτού του lncRNA είχε ως αποτέλεσμα μειωμένο πολλαπλασιασμό καρκίνου (Εικ. 1b).Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την ανάλυση MTS σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου που έδειξε ότι ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων knockdown DARS-AS1 μειώθηκε μόνο στο μισό σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 1c) και ήταν συνεπής με προηγούμενες αναφορές αρκετών άλλων τύπων καρκίνου.: διαυγοκυτταρικός καρκίνος νεφρού, καρκίνος θυρεοειδούς και μη μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύμονα51,52,53,55.Ωστόσο, η λειτουργία και οι μοριακοί μηχανισμοί του στον καρκίνο του παχέος εντέρου παραμένουν ανεξερεύνητες.Επομένως, επιλέξαμε αυτό το lncRNA για περαιτέρω μελέτη.
Για να μελετήσουμε την έκφραση του DARS-AS1 σε ασθενείς, αναλύσαμε διεξοδικά 10.327 δείγματα όγκου από το έργο Cancer Genome Atlas (TCGA).Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το DARS-AS1 εκφράζεται ευρέως και ρυθμίζεται σημαντικά σε υγιή κύτταρα σε μια ποικιλία όγκων, συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου (COAD), του καρκινώματος των διαυγών κυττάρων του νεφρού (KIRC) και του καρκινώματος των θηλωδών κυττάρων των νεφρών (KIRP)..Πολύ λίγα (Εικ. 1δ και Συμπληρωματικό Σχ. 1α, β). Η ανάλυση ζευγαρωμένων δειγμάτων υγιών/όγκων επιβεβαίωσε περαιτέρω μια σημαντικά υψηλότερη έκφραση του DARS-AS1 στους όγκους του ουροθηλιακού καρκινώματος της ουροδόχου κύστης (BLCA), του νεφρικού νεφρικού διαυγούς καρκινώματος (KIRC), του αδενοκαρκίνου του προστάτη (PRAD), του καρκινώματος πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα (LUSC) , καρκίνωμα ενδομητρίου σώματος της μήτρας (UCEC), αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (LUAD), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα ήπατος (LIHC), καρκίνωμα νεφρικού θηλώδους κυττάρου (KIRP) και αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου (COAD) (τιμή p < 0,05) (Εικ. 1e–m) . Η ανάλυση ζευγαρωμένων δειγμάτων υγιών/όγκων επιβεβαίωσε περαιτέρω μια σημαντικά υψηλότερη έκφραση του DARS-AS1 στους όγκους του ουροθηλιακού καρκινώματος της ουροδόχου κύστης (BLCA), του νεφρικού νεφρικού διαυγούς καρκινώματος (KIRC), του αδενοκαρκίνου του προστάτη (PRAD), του καρκινώματος πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα (LUSC) , καρκίνωμα ενδομητρίου σώματος της μήτρας (UCEC), αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (LUAD), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα ήπατος (LIHC), καρκίνωμα νεφρικού θηλώδους κυττάρου (KIRP) και αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου (COAD) (τιμή p < 0,05) (Εικ. 1e–m) .Η ανάλυση ζευγαρωμένων δειγμάτων υγιών/όγκων επιβεβαίωσε επίσης σημαντικά υψηλότερη έκφραση του DARS-AS1 σε όγκους ουροθηλιακό καρκίνωμα ουροδόχου κύστης (BLCA), καρκίνωμα νεφρών και νεφρικών κυττάρων (KIRC), αδενοκαρκίνωμα προστάτη (PRAD), καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου πνεύμονα (LUSC)., καρκινομετρικό καρκινομετρικό καρκινοματικο (UCEC), αδενοκαρκινομα λεγκογο (LUAD), γεπατοκελλυλιαρναια καρκινομα πεχενι (LIHC), παπιλλυαρνο-κλεοτικο καρκινομα ποκα (KIRP) και αδενοκαρκινομα τολστοΑΔ) (0.5) Μ) . , καρκίνωμα του ενδομητρίου του σώματος της μήτρας (UCEC), αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (LUAD), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα του ήπατος (LIHC), θηλώδες κυτταρικό καρκίνωμα του νεφρού (KIRP) και αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου (COAD) (p τιμή < 0,05) (Εικ. 1e– m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 癌 癌 癌 细胞癌 肺腺癌 肺腺癌 肾 肾 肾 肾 肾 乳头状 ς <0,05）(图1e-m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 (kirp) (coad) (p 值<0,05) (图1e-m) .Η ανάλυση δειγμάτων ζευγών υγιών/όγκων υποστήριξε περαιτέρω τον ρόλο του DARS-AS1 σε όγκους ουροθηλιακού καρκίνωμα ουροδόχου κύστης (BLCA), καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων διαυγών κυττάρων (KIRC), αδενοκαρκίνωμα προστάτη (PRAD) και καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου πνεύμονα (LUSC).экспрессия при карцином тела матки (UCEC), αδενοκαρκινομε λεξογονο (LUAD), γεπατοκελλλюлярной карцином (LIHC), ανεπάρκεια καρκινώματος (KIRP) και αδενοκαρκινομε γλυκο (τολ. -Μ). έκφραση σε καρκίνωμα του σώματος της μήτρας (UCEC), αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (LUAD), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (LIHC), καρκίνωμα νεφρικού θηλώδους κυττάρου (KIRP) και αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου (COAD) (τιμή p <0,05) (Εικόνα 1e -m).Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το DARS-AS1 εκφράζεται ευρέως και σε μεγάλο βαθμό σε μια ποικιλία καρκίνων.
Επειδή το DARS-AS1 και το DARS (το γονίδιο που κωδικοποιεί τον αντιπληροφοριακό κλώνο) μοιράζονται τον ίδιο προαγωγέα και βρίσκονται το ένα δίπλα στο άλλο, σχεδιάσαμε το shRNA για να καταργεί ειδικά το DARS-AS1 αλλά όχι το DARS (Συμπληρωματικό Σχήμα 2a,b και Συμπληρωματικός Πίνακας 2 ) .Εκτός από το SW620, χρησιμοποιήσαμε επίσης τρεις άλλες κυτταρικές σειρές που εκφράζουν έντονα το DARS-AS1 για να μελετήσουμε την αποτελεσματικότητα και τη λειτουργία του knockdown shRNA (Συμπληρωματικός Πίνακας 3).Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι και τα τρία shRNA που αναπτύχθηκαν πέτυχαν τουλάχιστον 80% αποτελεσματικότητα εξουδετέρωσης του DARS-AS1 με μικρή επίδραση στην ποσότητα του mRNA του DARS (Συμπληρωματικό Σχήμα 2c–f).Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι το νοκ ντάουν του DARS-AS1 με αυτά τα shRNA ανέστειλε σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου SW620 (49,7%) και HCT116 (27,7%), κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MBA-MD-231 (53,4%).) και την κυτταρική σειρά ηπατώματος HepG2 (μείωση 92,7%), καθώς και την ικανότητά τους να σχηματίζουν μη αγκυρωμένες σφαίρες (μέση μείωση ~50,8%, 44,6%, 40,7% και 75,7% ανά κυτταρική σειρά) (Εικ. 2a,b).Στο SW620, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας σχηματισμού αποικίας επιβεβαίωσαν περαιτέρω ότι το DARS-AS1 shRNA ανέστειλε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με μέση μείωση περίπου 69,6% (Εικ. 2γ).
Επίδραση του shRNA ελέγχου και του DARS-AS1 shRNA στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (α) και στον σχηματισμό σφαιροειδών (β) σε κύτταρα SW620, HCT116, MBA-MD-231 και HepG2.γ Επίδραση του shRNA ελέγχου και του shRNA του DARS-AS1 στον σχηματισμό αποικιών σε κύτταρα SW620.Πολλαπλασιασμός κυττάρων (d), σχηματισμός σφαιροειδούς (e) και σχηματισμός αποικίας (f) κυττάρων SW620 που υπερεκφράζουν το DARS-AS1.Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι η μέση ± τυπική απόκλιση τριών πειραμάτων.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 και *** p ≤ 0,001 από τη δοκιμή t Student δύο ουρών.
Για να συμπληρώσουμε τις μελέτες απώλειας λειτουργίας, δημιουργήσαμε στη συνέχεια κύτταρα SW620 που υπερεκφράζουν το DARS-AS1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2g).Η υπερέκφραση DARS-AS1 αύξησε σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη (1,8 φορές), τον σχηματισμό μη αγκυροβολημένου σφαιροειδούς (1,4 φορές) και τον σχηματισμό αποικιών (3,3 φορές) στα κύτταρα SW620 (Εικ. 2d–f).Επιβεβαιώσαμε αυτό το αποτέλεσμα χρησιμοποιώντας μια άλλη κυτταρική σειρά που εκφράζει το DARS-AS1, την A549.Αυτός ο ενισχυμένος κυτταρικός πολλαπλασιασμός λόγω της υπερέκφρασης DARS-AS1 παρατηρήθηκε περαιτέρω σε κύτταρα Α549 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2h, i και Συμπληρωματικός Πίνακας 3).Συνολικά, αυτές οι μελέτες κέρδους και απώλειας καταδεικνύουν ότι το DARS-AS1 προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων in vitro.
Για να διερευνήσουμε τον υποκείμενο μηχανισμό μέσω του οποίου το DARS-AS1 ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, πραγματοποιήσαμε μια pull-down ανάλυση RNA για να εντοπίσουμε τους πιθανούς εταίρους του που δεσμεύουν πρωτεΐνες.Τα αποτελέσματα RT-qPCR έδειξαν ότι περίπου το 86,2% του DARS-AS1 βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων SW620 (Συμπληρωματικό Σχήμα 3a).Το in vitro μεταγραμμένο βιοτινυλιωμένο DARS-AS1 ή ψευδοRNA στη συνέχεια επωάστηκε με προϊόντα λύσης κυττάρων SW620 που ακολουθήθηκε από διαχωρισμό SDS-PAGE.Η επακόλουθη χρώση με άργυρο έδειξε ότι μια ξεχωριστή ζώνη (~38 kDa) εμπλουτίστηκε σημαντικά σε δείγματα έλξης DARS-AS1 αλλά όχι σε δείγματα εικονικού RNA ή σφαιριδίων (Εικ. 3a).Αυτή η ζώνη αναγνωρίστηκε ως πρωτεΐνη ενεργοποίησης PKR (PACT) με φασματομετρία μάζας (MS) και επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανοσοστύπωση σε κυτταρικές σειρές SW620, HCT116 και HepG2 (Εικ. 3a,b).Ο εμπλουτισμός του DARS και των σχετικών πρωτεϊνών PACT - PKR και TRBP - διερευνήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ανάλυση RNA με Western blotting (WB).Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν βρέθηκε άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ του DARS-AS1 RNA και αυτών των τριών πρωτεϊνών (Συμπληρωματικό Σχήμα 3β).Η ειδική αλληλεπίδραση μεταξύ DARS-AS1 και PACT επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση ανοσοκατακρήμνισης RNA (RIP), η οποία έδειξε ότι το DARS-AS1 εμπλουτίστηκε σημαντικά σε αντισώματα αντι-PACT αλλά όχι σε άλλα RNA ελέγχου (Εικόνα 3γ).Για να προσδιοριστεί εάν το DARS-AS1 αλληλεπιδρά απευθείας με το PACT απουσία οποιωνδήποτε άλλων κυτταρικών συστατικών, πραγματοποιήθηκε in vitro προσδιορισμός συμβολομετρίας βιοστιβάδων (BLI) χρησιμοποιώντας καθαρισμένο PACT.Το επισημασμένο με βιοτίνη DARS-AS1 ή εικονικό RNA ακινητοποιήθηκε σε βιοαισθητήρες στρεπταβιδίνης (SA) και στη συνέχεια επωάστηκε σε κινητικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 1 μM PACT.Συγκεκριμένα, το PACT δεσμεύτηκε ισχυρά με το DARS-AS1 (τιμή KD ~26,9 nM), αλλά όχι για να μιμηθεί το RNA (Εικόνα 3δ).Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μια άμεση αλληλεπίδραση και υψηλή συγγένεια μεταξύ DARS-AS1 και PACT.
Η ανάλυση έλξης RNA εντόπισε το DARS-AS1 να αλληλεπιδρά με το PACT σε κύτταρα SW620.Παραπάνω, χρώση με ασήμι σχετικών πρωτεϊνών.Πραγματοποιήθηκαν κατώτερες ανοσοκηλίδες με αντίσωμα anti-PACT.b RNA pull-down ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HCT116 (πάνω) και HepG2 (κάτω).Ο εμπλουτισμός PACT ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωση.Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές ανοσοκατακρήμνισης cRNA (RIP) σε κύτταρα SW620 χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.d Καμπύλες δέσμευσης PACT σε πλήρους μήκους DARS-AS1 ή RNA ελέγχου ελήφθησαν χρησιμοποιώντας συμβολομετρία βιοστιβάδων (BLI).Το RNA ακινητοποιήθηκε σε έναν βιοαισθητήρα στρεπταβιδίνης.Για τη μέτρηση της συσχέτισης χρησιμοποιήθηκε 1 μM PACT.Η δοκιμασία έλξης RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένο πλήρους μήκους DARS-AS1 ή περικομμένο (πάνω).Ανοσοκηλίδα που δείχνει λήφθηκε PACT (κάτω).f Το καθαρισμένο επισημασμένο PACT επωάστηκε με βιοτινυλιωμένο πλήρους μήκους DARS-AS1 ή περικόπηκε (όπως στο e) για in vitro προσδιορισμό RIP.Το εκχυλισμένο RNA επαληθεύτηκε με RT-qPCR.g Η σχετική συγγένεια διαφορετικών θραυσμάτων RNA για PACT ελήφθη χρησιμοποιώντας συμβολομετρία βιοστιβάδων.Για ανάλυση, χρησιμοποιήθηκαν 100 nM RNA και 1 μM RAST.h In vitro αναλύσεις RIP πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας καθαρισμένο άθικτο ή κολοβωμένο επισημασμένο PACT.Το εκχυλισμένο RNA επαληθεύτηκε με RT-qPCR.i Ρυθμός ανάπτυξης κυττάρων SW620 που υπερεκφράζουν DARS-AS1, PACT ή και τα δύο.j Η υπερέκφραση πλήρους μήκους ή περικομμένου DARS-AS1 σε κύτταρα SW620 είχε διαφορετικά αποτελέσματα στην κυτταρική ανάπτυξη.k Η απόπτωση ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-PARP.l Knockout του DARS-AS1 προκαλεί απόπτωση των κυττάρων SW620 όπως φαίνεται από την κυτταρομετρία ροής.Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι η μέση ± τυπική απόκλιση τριών πειραμάτων. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, από τη δοκιμή t δύο ουρών Student. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, από τη δοκιμή t δύο ουρών Student. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 από το t-test Student δύο ουρών. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 από το t-test Student δύο ουρών.
Στη συνέχεια δημιουργήσαμε τρία βιοτινυλιωμένα θραύσματα DARS-AS1 RNA με in vitro μεταγραφή για να αναγνωρίσουμε την περιοχή DARS-AS1 που απαιτείται για τη σύνδεση PACT (Εικόνα 3e).Τα αποτελέσματα της ανάλυσης RNA έδειξαν ότι κάθε θραύσμα ήταν σε θέση να αλληλεπιδράσει με το PACT, αλλά η 3'-τελική περιοχή (384-768 νουκλεοτίδια με επισήμανση A3) έδειξε περισσότερα από 1-384 νουκλεοτίδια με επισήμανση A1) (Εικ. 3e).Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στον in vitro προσδιορισμό RIP χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένο PACT (Εικόνα 3στ).Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, πειράματα για τη σύνδεση ακινητοποιημένων θραυσμάτων RNA στο PACT χρησιμοποιώντας BLI έδειξαν επίσης ότι το PACT έχει υψηλότερη συγγένεια για το A3 (384-768 nt) (τιμή KD περίπου 94,6 nM), ενώ σχεδόν καμία σύνδεση με άλλες περιοχές.(Εικ. 3δ).
Εξετάσαμε επίσης τις σχετικές περιοχές δέσμευσης στο PACT.Το PACT περιέχει τρεις λειτουργικές περιοχές, δύο από τις οποίες είναι διατηρημένες δίκλωνες περιοχές δέσμευσης RNA (dsRBD) και μια τρίτη περιοχή (ονομαζόμενη D3) που δρα ως ενεργοποιητής πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων.Για να εξετάσουμε την ικανότητα δέσμευσης lncRNA κάθε τομέα, κατασκευάσαμε τρεις μεταλλάξεις που αφαίρεσαν καθεμία από τις τρεις περιοχές και πραγματοποιήσαμε μια in vitro δοκιμασία RIP.Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η διαγραφή του τρίτου τομέα (D3) του PACT μείωσε σημαντικά την αλληλεπίδρασή του με το DARS-AS1 (κατά 0,11 φορές σε σύγκριση με το ανέπαφο PACT) σε σύγκριση με τις άλλες δύο μεταλλάξεις (Εικ. 3h), αποδείχθηκε ότι η απελευθέρωση του D3 αλληλεπίδρασε με το DARS.-AC1.Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ DARS-AS1 και PACT μπορεί να συμβεί κυρίως μέσω του 3' άκρου του DARS-AS1 και του τομέα D3 του PACT.
Σημειώσαμε ότι το DARS-AS1 δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση PACT και το PACT δεν είχε καμία επίδραση στο DARS-AS1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 3γ).Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση του knockdown PACT στην ανάπτυξη των κυττάρων.Σε αντίθεση με το DARS-AS1, τα σχετικά κύτταρα αυξήθηκαν 1,5–3 φορές πιο γρήγορα όταν το PACT καταρρίφθηκε (Συμπληρωματικό Σχήμα 3δ).Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας σχηματισμού αποικιών έδειξαν ότι τα κύτταρα σχημάτισαν 2-3 φορές αποικίες μετά από επεξεργασία shRNA με PACT (Συμπληρωματικό Σχήμα 3e).Για να ελέγξουμε εάν το DARS-AS1 ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω του PACT, δημιουργήσαμε κύτταρα SW620 που υπερεκφράζουν το PACT, το DARS-AS1 ή και τα δύο.Η υπερέκφραση του PACT έδειξε σημαντική αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Εικόνα 3i).Ενώ η υπερέκφραση DARS-AS1 αυτή καθαυτή προήγαγε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων που υπερέκφραζαν τα DARS-AS1 και PACT.Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το PACT μπορεί να εξουδετερώσει τον αυξημένο πολλαπλασιασμό που προκαλείται από την υπερέκφραση του DARS-AS1.
Δεδομένου ότι διαφορετικές περιοχές του DARS-AS1 έχουν διαφορετικές ικανότητες δέσμευσης PACT, ερευνήσαμε τη σχετική τους επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με διαφορετική υπερέκφραση των θραυσμάτων DARS-AS1.Σε σύγκριση με τα άλλα δύο θραύσματα, το DARS-AS1 υπερεκφράστηκε στο 3' άκρο (384–768 nt), την κύρια περιοχή που σχετίζεται με το PACT στο DARS-AS1, το οποίο είχε την υψηλότερη ικανότητα να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Εικ. 3j).Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν μια θετική συσχέτιση μεταξύ της ικανότητας δέσμευσης και της βιολογικής λειτουργίας του DARS-AS1.
Η PACT έχει αναφερθεί ότι είναι μια προ-αποπτωτική πρωτεΐνη19.Επομένως, διερευνήσαμε την επίδραση του DARS-AS1 στην απόπτωση.Όπως αναμενόταν, το knockdown DARS-AS1 αύξησε σημαντικά τη διάσπαση PARP στα κύτταρα SW620 και αύξησε την αναλογία των θετικών σε αννεξίνη V κυττάρων σε κυτταρικές σειρές SW620, HCT116, HepG2 και MBA-MD-231 (Εικ. 3k).3).3f–h), υποδεικνύοντας ότι η αντι-αποπτωτική δράση του DARS-AS1 στα καρκινικά κύτταρα είναι αντίθετη από τη λειτουργία του PACT που προκαλεί απόπτωση.Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο μηχανισμός της ογκογόνου λειτουργίας του DARS-AS1 μπορεί να οφείλεται στην αναστολή της λειτουργίας PACT.
Στη συνέχεια, διερευνήσαμε τις λειτουργικές επιπτώσεις της συσχέτισης DARS-AS1-PACT.Το PACT έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιεί την PKR μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης, η οποία στη συνέχεια ενισχύει τη φωσφορυλίωση του eIF2α, προκαλώντας μεταφραστική διαγραφή και απόπτωση17.Αρχικά, εξετάσαμε εάν το DARS-AS1 επηρεάζει τον κυτταρικό εντοπισμό των PACT και PKR.Η ομοεστιακή μικροσκοπία φθορισμού έδειξε ότι τα PACT και PKR ήταν σε μεγάλο βαθμό εντοπισμένα σε κύτταρα SW620 με μέσο συντελεστή συσχέτισης Pearson 0,72.Εν τω μεταξύ, η υπερέκφραση DARS-AS1 μείωσε σημαντικά τον συνεντοπισμό PACT και PKR (μέσος συντελεστής συσχέτισης Pearson 0,61) (Εικόνα 4α).Για να διερευνήσουμε εάν το DARS-AS1 θα μπορούσε να τροποποιήσει την αλληλεπίδραση PACT-PKR, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία συν-ανοσοκαθίζησης (co-IP) με αντίσωμα αντι-PACT σε προϊόντα λύσης κυττάρων SW620.Το PKR εμπλουτίστηκε σε μεγάλο βαθμό σε αντι-PACT σε κύτταρα ελέγχου, ενώ η ανάκτηση PKR μειώθηκε σημαντικά σε προϊόντα λύσης από κύτταρα που υπερέκφραζαν DARS-AS1 (Εικ. 4β).Καθαρισμένα επισημασμένα PACT και PKR χρησιμοποιήθηκαν για in vitro προσδιορισμούς δέσμευσης πρωτεΐνης.Συνεπώς, εκείνα που παρείχαν DARS-AS1 αλλά όχι RNA ελέγχου έδειξαν κατασταλμένη αλληλεπίδραση PACT-PKR (Εικόνα 4γ).Όλα τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το DARS-AS1 διέκοψε την επικοινωνία PACT και PKR.
Παρατηρήθηκε συνεντοπισμός των PACT και PKR σε κύτταρα ελέγχου ή κύτταρα που υπερεκφράζουν το DARS-AS1 χρησιμοποιώντας ομοεστιακή μικροσκοπία φθορισμού.Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI.Τα στατιστικά αποτελέσματα προέκυψαν από 16 φωτογραφίες.β Συν-ανοσοκαθίζηση (co-IP) με χρήση αντισώματος anti-PACT σε κυτταρολύματα κυττάρων ελέγχου SW620 ή κύτταρα που υπερεκφράζουν το DARS-AS1.c Επισημασμένο PACT, καθαρισμένο PKR και μεταγραφή in vitro με DARS-AS1 ή ψευδές RNA επωάστηκαν για ανάλυση δέσμευσης πρωτεΐνης in vitro.Αντισώματα κατά της σημαίας χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκατακρήμνιση.d Πραγματοποιήθηκαν ανοσοκηλίδες με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα σε κύτταρα SW620 και HCT116 διαμολυνθέντα με shRNA ελέγχου ή DARS-AS1-shRNA ακολουθούμενα από λιμοκτονία ορού.Τα επίπεδα έκφρασης του DARS-AS1 άλλαξαν την κυτταρική ευαισθησία στη θαψιγαργίνη.Τα κύτταρα SW620 επιμολύνθηκαν με DARS-AS1 shRNA, πλασμίδιο υπερέκφρασης DARS-AS1 ή πλασμίδιο ελέγχου.Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με thapsigargin για 48 ώρες και προσδιορίστηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο MTS.f Μεταγραμμένο in vitro DARS-AS1 ή εικονικό RNA και καθαρισμένο PACT χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασία ενεργοποίησης in vitro και ανίχνευση ανοσοστύπωσης.g Ανοσοκηλιώσεις χρησιμοποιώντας αυτά τα αντισώματα πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα SW620-ctrl (αριστερά) ή κύτταρα που υπερεκφράζουν μεταλλάκτες PKR (δεξιά).Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με shRNA ελέγχου ή DARS-AS1-shRNA που ακολουθείται από λιμοκτονία ορού.Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι η απενεργοποίηση του μεταλλαγμένου PKR αντιστάθμισε την απόπτωση που προκαλείται από το DARS-AS1 στα κύτταρα SW620.i Πραγματοποιήθηκαν ανοσοκηλίδες με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα σε κύτταρα SW620 (αριστερά) ή HCT116 (δεξιά).Κύτταρα που έχουν διαμολυνθεί με shRNA ελέγχου ή DARS-AS1 shRNA στερούνται ορού και συμπληρώνονται με 100 ηΜ PKR C16 αναστολέα ή DMSO.Μπάρα κλίμακας = 5 μm.Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι η μέση ± τυπική απόκλιση τριών πειραμάτων.* p ≤ 0,05 Student's t-test δύο ουρών.
Γενικά πιστεύεται ότι μόλις το PACT αλληλεπιδράσει με το PKR17, μπορεί να προκληθεί φωσφορυλίωση PKR στο Thr451.Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το επίπεδο φωσφορυλίωσης PKR ήταν σημαντικά αυξημένο σε κύτταρα DARS-AS1 knockdown μετά από λιμοκτονία στον ορό (Εικ. 4δ και Συμπληρωματικό Σχήμα 4α).Συνεπώς, βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωση του eIF2α, του κύριου υποστρώματος PKR, αυξήθηκε επίσης σημαντικά από το DARS-AS1 shRNA (Εικ. 4d και Συμπληρωματικό Σχήμα 4α).Το Thapsigargin είναι ένας στρεσογόνος παράγοντας ER που προκαλεί το ER να απελευθερώνει Ca2+.Η θεραπεία με thapsigargin έχει αναφερθεί ότι επάγει την έκφραση και την ενεργοποίηση του PACT, το οποίο περαιτέρω αλληλεπιδρά και ενεργοποιεί την PKR, οδηγώντας σε απόπτωση αυξάνοντας τη φωσφορυλίωση του eIF2α 18,61.Εδώ, χρησιμοποιήσαμε την thapsigargin ως διεγέρτη της οδού PACT/PKR για να διερευνήσουμε εάν το DARS-AS1 μπορεί να βοηθήσει τα κύτταρα να ξεπεράσουν το στρες αναστέλλοντας την οδό PACT/PKR.Παρατηρήσαμε ότι το επίπεδο έκφρασης DARS-AS1 συσχετίστηκε θετικά με την κυτταρική αντίσταση στη θαψιγαργίνη.Τα κύτταρα SW620 που υπερέκφραζαν το DARS-AS1 επιβίωσαν καλύτερα όταν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με thapsigargin, ενώ τα κύτταρα με knockdown DARS-AS1 έγιναν πιο ευαίσθητα (Εικ. 4e).Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, η υπερέκφραση DARS-AS1 μείωσε τη φωσφορυλίωση PKR που προκαλείται από την θαψιγαργίνη (Συμπληρωματικό Σχήμα 4β).Αντίθετα, μετά τη θεραπεία με thapsigargin, το PKR και το eIF2α φωσφορυλιώθηκαν σε υψηλότερο βαθμό στα κύτταρα DARS-AS1 knockdown σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα 4β).Είναι ενδιαφέρον ότι η thapsigargin προκάλεσε την έκφραση DARS-AS1 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, ο οποίος μπορεί να υποδεικνύει μια αντιστρες λειτουργία του DARS-AS1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 4γ).Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε in vitro προσδιορισμούς ενεργοποίησης για να επιβεβαιώσουμε αυτές τις παρατηρήσεις.Εν συντομία, η PKR καθαρίστηκε από κυτταρολύματα χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-PKR, στη συνέχεια επωάστηκε με ανασυνδυασμένο PACT και DARS-AS1 μεταγράφηκε in vitro.Μετά την ενζυματική αντίδραση, ανιχνεύθηκε φωσφο-PKR χρησιμοποιώντας WB.Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση PKR αναστέλλεται σημαντικά από το DARS-AS1, αλλά όχι από το RNA ελέγχου (Εικόνα 4στ).Αυτά τα in vitro και in vivo αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το DARS-AS1 αναστέλλει την ενεργοποίηση PKR με τη μεσολάβηση PACT.Ταυτόχρονα, παρατηρήσαμε επίσης μείωση στην ανάκτηση PACT παρουσία DARS-AS1 (Εικόνα 4στ).Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με τα αποτελέσματα της in vitro δοκιμασίας δέσμευσης πρωτεΐνης (Σχήμα 4γ) και πάλι απεικονίζει τη λειτουργία αποκλεισμού του DARS-AS1 για τη σύνδεση PACT-PKR.
Τα Ser246 και Ser287 στην περιοχή D3 του PACT απαιτούνται για την ενεργοποίηση PKR υπό κυτταρικό στρες.Η αντικατάσταση δύο υπολειμμάτων σερίνης για την αλανίνη έδωσε το μεταλλαγμένο PACT (mutD), το οποίο ενεργοποίησε την PKR απουσία στρες και η υποκατάσταση της αλανίνης (mutA) ανέστρεψε το πρωτόκολλο.Δεδομένου ότι έχουμε αποδείξει τη σημασία αυτού του τομέα σε άμεση συσχέτιση με το DARS-AS1, δημιουργήσαμε αυτά τα δύο μεταλλάγματα PACT για να ελέγξουμε εάν αυτά τα υπολείμματα θα μπορούσαν επίσης να εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση με το DARS-AS1.Είναι ενδιαφέρον ότι και οι δύο μεταλλάκτες έχασαν την ικανότητα δέσμευσης στο DARS-AS1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 4δ), υποδηλώνοντας ότι η πλήρης δομή της πρωτεΐνης PACT μπορεί να απαιτείται για αποτελεσματική αλληλεπίδραση με το DARS-AS1.
Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν επίσης ότι η επαγόμενη από το DARS-AS1-shRNA αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μπορεί να αποκατασταθεί εν μέρει με την υπερέκφραση ενός κυρίαρχου αρνητικού PACT μετάλλαξης (PACTmutA) ή ενός κυρίαρχου αρνητικού μεταλλάγματος PKR (PKRmut) (Συμπληρωματικό Σχήμα 4e. e).Η υπερέκφραση των κυρίαρχων-αρνητικών μεταλλαγμάτων PKR μείωσε τη φωσφορυλίωση της PKR που προκαλείται από την καταστροφή του DARS-AS1 καθώς και τη φωσφορυλίωση eIF2α σε κύτταρα που στερούνται ορού (Εικ. 4g).Πιο σημαντικό, η αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων που προκλήθηκαν από την αναστολή του DARS-AS1 μειώθηκε επίσης σε κύτταρα που υπερέκφραζαν PKRmut (Εικ. 4h και Συμπληρωματικό Σχήμα 4g).Η αναστολή της δραστηριότητας της PKR κινάσης βλάπτει επίσης τη λειτουργία DARS-AS1, καθώς τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή του DARS-AS1 σπάνια πυροδότησε φωσφορυλίωση PKR και eIF2α όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με έναν ειδικό για PKR αναστολέα C16 (Εικ. 4i και Συμπληρωματικό Σχήμα 4).).Συνολικά, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το DARS-AS1 προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τουλάχιστον εν μέρει, αναστέλλοντας την ενεργοποίηση PKR με τη μεσολάβηση PACT.
Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τον ρόλο του DARS-AS1 στην ογκογένεση, πραγματοποιήσαμε πειράματα in vivo χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η καταστροφή του DARS-AS1 μείωσε δραματικά την ανάπτυξη όγκου σε ποντίκια (τιμή p < 0,0001) (Εικ. 5a). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η καταστροφή του DARS-AS1 μείωσε δραματικά την ανάπτυξη όγκου σε ποντίκια (τιμή p < 0,0001) (Εικ. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли во мышей (σημασία p <0,0001) (ρ. 5α). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το knockdown DARS-AS1 μειώνει δραστικά την ανάπτυξη όγκου σε ποντίκια (τιμή p < 0,0001) (Εικόνα 5α).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）、 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли во мышей (σημασία р <0,0001) (рис. 5α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το knockdown DARS-AS1 μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη όγκου σε ποντίκια (τιμή p < 0,0001) (Εικόνα 5α).Έτσι, στην ομάδα knockdown DARS-AS1, υπήρξε σημαντική μείωση του μέσου όγκου όγκου κατά περίπου 72,9% και της μέσης μάζας όγκου κατά περίπου 87,8% (Εικόνα 5β-δ).Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν έντονα ότι το DARS-AS1 μπορεί να προάγει σημαντικά την ανάπτυξη όγκου in vivo.
Επιδράσεις της καταστροφής του DARS-AS1 στην ογκογένεση του παχέος εντέρου σε γυμνά ποντίκια.Εμφανίζονται οι καμπύλες ανάπτυξης (α), το μέγεθος του όγκου (b), το βάρος (c) και οι εικόνες όγκου (δ).Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, από δοκιμή t Student δύο ουρών. n = 10. ****p < 0,0001, από δοκιμή t Student δύο ουρών. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 t-test Student με δύο ουρές.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 T-test Student δύο ουρών.Ο Kaplan-Meier ανέλυσε τη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης DARS-AS1 και της συνολικής επιβίωσης σε ασθενείς με UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM και LGG.Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του DARS-AS1 στους ασθενείς ήταν στο κορυφαίο 50%.το χαμηλό επίπεδο έκφρασης DARS-AS1 στους ασθενείς ήταν στο κατώτερο 50%.Οι τιμές p προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή log rank.f Προτεινόμενο μοντέλο στο οποίο το DARS-AS1 ρυθμίζει την οδό PACT-PKR και την ανάπτυξη του όγκου.
Για να κατανοήσουμε καλύτερα την κλινική επίδραση του DARS-AS1, εξετάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασής του και της επιβίωσης των ασθενών.Αναλύοντας το σύνολο δεδομένων TCGA, διαπιστώσαμε ότι η υψηλότερη έκφραση DARS-AS1 σχετίστηκε με μελάνωμα ραγοειδούς (UVM), νεφρική χρωμοφοβία (KICH), καρκίνωμα νεφρικού θηλώδους κυττάρου (KIRP), μεσοθηλίωμα (MESO), πολυπλεξία.Η χαμηλότερη επιβίωση συσχετίστηκε σημαντικά με τη μορφοποίηση του γλοιοβλαστώματος (GBM) και τους ασθενείς με χαμηλού βαθμού γλοίωμα εγκεφάλου (LGG) (Εικόνα 5ε).Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το DARS-AS1 μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην κλινική εξέλιξη του όγκου και μπορεί να είναι ένας πιθανός προγνωστικός βιοδείκτης σε πολλαπλούς καρκίνους.
Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας μεγάλης κλίμακας λειτουργικό έλεγχο CRISPRi, προσδιορίσαμε ότι το DARS-AS1 lncRNA υπερνικά το στρες των καρκινικών κυττάρων ρυθμίζοντας δύο βασικούς παράγοντες ανταπόκρισης στο στρες, τον PACT και τον PKR.Αλληλεπιδρώντας απευθείας με το PACT, το DARS-AS1 ανέστειλε την ενεργοποίηση PKR με τη μεσολάβηση PACT, αποτρέποντας έτσι τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και προάγοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Εικ. 5στ).Η ανοδική ρύθμιση του DARS-AS1 έχει παρατηρηθεί σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, υποδηλώνοντας ότι η λειτουργία του να προάγει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων κάτω από στρεσογόνες συνθήκες μπορεί να είναι ευρέως εφαρμόσιμη σε πολλούς τύπους καρκίνου.
Το PACT έχει αναγνωριστεί ως πρωτεΐνη ενεργοποιητή PKR και η ενεργοποίηση PKR με τη μεσολάβηση PACT παίζει σημαντικό ρόλο στις αποκρίσεις στο στρες ρυθμίζοντας τη μεταγραφή, τη μετάφραση, την απόπτωση και άλλες σημαντικές κυτταρικές διεργασίες62.Για δεκαετίες, έχουν γίνει προσπάθειες για την κατανόηση της ειδικής για τον καρκίνο ρύθμιση του καταρράκτη PACT-PKR.Εδώ, η μελέτη μας αποκάλυψε έναν διαφορετικό μηχανισμό ρύθμισης του PACT-PKR στα καρκινικά κύτταρα μέσω του κυτταρικού lncRNA DARS-AS1, το οποίο συνδέεται άμεσα με το PACT, εμποδίζει την αλληλεπίδραση PACT-PKR, αναστέλλει την ενεργοποίηση PKR και τη φωσφορυλίωση eIF2α, αναστέλλοντας έτσι την απόπτωση που προκαλείται από το στρες και τόνωση του ενδεχόμενου πολλαπλασιασμού του καρκίνου.κύτταρα.Αυτή η ανακάλυψη ρίχνει φως σε πιθανούς στόχους lncRNA για την πρόγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου.
Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι το knockdown DARS-AS1 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα στην πείνα στον ορό με σημαντική αύξηση στη φωσφορυλιωμένη PKR και eIF2α.Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το DARS-AS1 προάγει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων κάτω από σκληρές συνθήκες αναστέλλοντας τη δραστηριότητα PACT/PKR.Αρκετά άλλα μη κωδικοποιητικά RNA, όπως το ASPACT και το nc886, εμπλέκονται επίσης στον άξονα PACT/PKR ρυθμίζοντας προς τα κάτω το mRNA PACT48 ή ρυθμίζοντας την αυτοφωσφορυλίωση με δέσμευση στο PKR49,50,64.Μεταξύ αυτών, το DARS-AS1 δρα ως διαταράκτης του συνδέσμου PACT-PKR.Αυτή η μελέτη εμπλουτίζει την κατανόησή μας για τη ρύθμιση του άξονα PACT/PKR και τον ρόλο των lncRNAs στις αποκρίσεις στρες.
Το PACT περιέχει τρεις ξεχωριστούς τομείς.Καθένα από τα δύο πρώτα dsRBD είναι επαρκή για την επίτευξη υψηλής συγγένειας σύνδεσης του PACT στο PKR, ενώ ο τρίτος τομέας (D3) απαιτείται για την ενεργοποίηση PKR in vitro και in vivo.Η μελέτη μας έδειξε ότι το DARS-AS1 αλληλεπιδρά κατά προτίμηση με τον τομέα D3 (Εικ. 3h).Δεδομένου του μεγάλου μεγέθους του lncRNA (768 νουκλεοτίδια), η δέσμευση του DARS-AS1 με το D3 μπορεί να αναστείλει φυσικά την αλληλεπίδραση μεταξύ του τομέα PACT του dsRBD και του PKR, εμποδίζοντας έτσι τη σύνδεση του PACT και του PKR.Οι σημειακές μεταλλάξεις PACT που αντικατέστησαν τα Ser246 και Ser287 στο D3 με αλανίνη ή ασπαρτικό διέκοψαν τη δεσμευτική του συγγένεια για το DARS-AS1, υποδεικνύοντας τη σημασία των συνολικών δομικών και ηλεκτρικών ιδιοτήτων του D3 στη συσχέτιση τους.Περισσότερες λεπτομέρειες αυτού του μηχανισμού θα απαιτηθούν στο μέλλον, χρησιμοποιώντας πιο ακριβή βιοχημική ανάλυση και δομική ανάλυση PACT υψηλής ανάλυσης.
Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι το DARS-AS1 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω αρκετών μηχανισμών51,52,53.Σε ένα παράδειγμα, οι ερευνητές παρατήρησαν ότι το DARS-AS1 ρύθμισε προς τα πάνω το γονίδιο DARS που κωδικοποιεί την αντιπληροφοριακή πρωτεΐνη στοχεύοντας το miP-194-5p σε καρκινικά κύτταρα νεφρού.Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη, το knockdown DARS-AS1 είχε μικρή επίδραση στη μεταγραφή του DARS σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων τουλάχιστον των καρκίνων του παχέος εντέρου, του μαστού και του ήπατος.Επειδή τα lncRNA εμφανίζουν μοτίβα έκφρασης ειδικά για κύτταρα και ιστούς, οι λειτουργικοί μηχανισμοί ενδέχεται να μην διατηρηθούν σε όλους τους τύπους καρκίνου, γεγονός που μπορεί να συμβάλλει σε αυτήν την ασυμφωνία μεταξύ των παρατηρήσεών μας και των προηγούμενων αξιολογήσεων διαφορετικών καρκίνων.Απαιτούνται ειδικές μελέτες για την αποσαφήνιση των ειδικών μηχανισμών διαφόρων φυσιολογικών και παθολογικών διεργασιών.
Μια ανάλυση κλινικών δεδομένων έδειξε ότι η έκφραση DARS-AS1 σε όγκους συσχετίζεται αντιστρόφως με την επιβίωση των καρκινοπαθών, γεγονός που υπογραμμίζει τη σημασία του άξονα DARS-AS1/PACT/PKR στην πρόγνωση του καρκίνου.Συμπερασματικά, η μελέτη μας δείχνει ότι το DARS-AS1 είναι ρυθμιστής του άξονα σηματοδότησης PACT/PKR, προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και αναστέλλει την απόπτωση κατά την απόκριση στο στρες, κάτι που παρέχει μια άλλη γραμμή έρευνας και ενδιαφέρει μελλοντική έρευνα για πιθανές θεραπείες .
Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 και HEK293T ελήφθησαν από την Εθνική Υποδομή Πόρων Κυτταρικής Γραμμής στην Κίνα.Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ) συμπληρωμένο με 10% FBS (Gemini, Brooklyn, ΝΥ) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Thermo Fisher Scientific) στους 37°C, 5% CO2.εκκολαπτήριο.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (φωσφο-Τ451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));αντι-eIF2α (φώσφορος S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);αντι-β-τουμπουλίνη, CST (2128);κανονική IgG ποντικιού, CST (5415S);κανονικό IgG κουνελιού, CST (2729S).Τα αντισώματα αραιώθηκαν 1:1000 σε PBST για στύπωμα Western και 1:100 για IP.
Τα sgRNA αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα δημοσίως διαθέσιμο εργαλείο που ονομάζεται CRISPR-ERA66.Χρησιμοποιήσαμε τις προεπιλεγμένες παραμέτρους του εργαλείου για την ανάπτυξη sgRNA και ο αλγόριθμος υπολόγισε τις θέσεις δέσμευσης sgRNA στην περιοχή των 3 kb.με κέντρο το TSS.Δεξαμενές ολιγονουκλεοτιδίων sgRNA συντέθηκαν στην CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) και κλωνοποιήθηκαν σε εξανθρωπισμένα πλασμίδια pgRNA (Addgene #44248).Συνολικά 12 μg συνενωμένου ανθρωποποιημένου πλασμιδίου pgRNA, 7,2 μg psPAX2 (Addgene #12260) και 4,8 μg pMD2.G (Addgene #12259) συνεπιμολύνθηκαν σε 5 x 106 HEK293T σε 10 cm αναδιαμόρφωσης DNA κύτταρα (CWBIO, Πεκίνο, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.Τα υπερκείμενα που περιείχαν ιό συλλέχθηκαν 48 και 72 ώρες μετά τη διαμόλυνση και διηθήθηκαν μέσω φίλτρου 0,45 μm.Για διαλογή, κύτταρα SW620 που εκφράζουν την πρωτεΐνη σύντηξης dCas9/KRAB ελήφθησαν με μεταγωγή ιού.Τροποποιημένα κύτταρα SW620 μολύνθηκαν με τη βιβλιοθήκη ιών σε τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα μόλυνσης σε ΜΟΙ 0,1-0,3 και ελήφθησαν δείγματα με 2 μg/ml πουρομυκίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ) για 2 ημέρες.Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 18 ημέρες in vitro με ελάχιστη κάλυψη βιβλιοθήκης 500 κύτταρα/sgRNA για διαλογή.
Το γονιδιωματικό DNA εκχυλίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ QIAamp DNA Blood Midi (QIAGEN, Düsseldorf, Γερμανία, 51183).Συνολικά, 100 μg γονιδιωματικού DNA ανά βιολογική επανάληψη χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή της βιβλιοθήκης.Η περιοχή sgRNA ενισχύθηκε με δύο γύρους PCR και συνδέθηκε με έναν γραμμωτό κώδικα.
Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας γέλη NucleoSpin® και κιτ καθαρισμού PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Γερμανία; 740609.250) και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης δίκλωνου DNA Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Ο προσδιορισμός MTS χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε αρχική πυκνότητα 2000 κύτταρα/φρεάτιο.Ο σχετικός αριθμός κυττάρων μετρήθηκε καθημερινά στον υποδεικνυόμενο χρόνο για συνολικά 4-6 ημέρες.Για κάθε φρεάτιο, 20 μl αντιδραστηρίου MTS (Promega) αραιώθηκαν με 100 μl DMEM, επωάστηκαν με κύτταρα για 4 ώρες στους 37°C και στη συνέχεια μετρήθηκε το OD490.
Η ικανότητα για μη αγκυροβολημένη ανάπτυξη ανακαλύφθηκε με την ανάλυση του σχηματισμού σφαιρών.Εν συντομία, 2000 κύτταρα διαμολυνθέντα με shRNA DARS-AS1 ή shRNA ελέγχου καλλιεργήθηκαν σε μικροπλάκες εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης (Corning) με μεταβολή του μέσου κάθε 4 ημέρες.Τα σφαιροειδή μετρήθηκαν μετά από 14 ημέρες.500 κύτταρα επιμολυνθέντα με το πλασμίδιο υπερέκφρασης DARS-AS1 ή ένα πλασμίδιο ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό ενίσχυσης, διαφορετικά η μέθοδος παρέμεινε αμετάβλητη.
Το RNA μεταγράφηκε χρησιμοποιώντας Τ7 RNA πολυμεράση και βιοτίνη-16-UTP (Roche 1138908910) σύμφωνα με τις οδηγίες της Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται εδώ παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 4.
Οι περιοχές PACT ή PKR που κωδικοποιούν πρωτεΐνη κλωνοποιήθηκαν σε pET15b (Addgene #73619) και μετασχηματίστηκαν σε BL21 (DE3).Τα βακτήρια επωάστηκαν όλη τη νύχτα σε LB εφοδιασμένο με αμπικιλλίνη και στη συνέχεια αραιώθηκαν 100 φορές με φρέσκο ​​LB.Όταν το OD600 του μέσου έφθασε στο 0,8, προστέθηκε 1 mM IPTG για να προκληθεί έκφραση πρωτεΐνης.Μετά από επώαση όλη τη νύχτα με ήπια ανακίνηση (250 rpm στους 20°C), το κυτταρικό ίζημα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση (4000 rpm, 10 λεπτά, 4°C).Επαναιωρήστε το κυτταρικό ίζημα σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) και επωάστε σε πάγο για 30 λεπτά, στη συνέχεια υποβάλετε σε υπερήχους (15 λεπτά, 5 s on/off, σε πάγο) και φυγοκεντρήστε (13.000 σ.α.λ.)., 30 λεπτά, 4°С).Το υπερκείμενο στη συνέχεια φορτώθηκε σε ρητίνη Ni-NTA (QIAGEN) 3 φορές στους 4°C, πλύθηκε 4 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (50 mM Tris, ρΗ 8,0, 40 mM ιμιδαζόλη, 250 mM NaCl) και εκλούστηκε 3 φορές, με συνολικό 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (50 mM Tris, ρΗ 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM ιμιδαζόλη).Η καθαρισμένη πρωτεΐνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας WB και η συγκέντρωση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης Qubit™ (Thermo Fisher Scientific, Q 33212).
Οι αναλύσεις RIP πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με τροποποιήσεις.Εν συντομία, 1x ρυθμιστικό διάλυμα RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, αναστολέας ριβονουκλεάσης RNasin (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, πρωτεάση) συνστατική λύση71 xcyto (Roche, 1 mM DTT) και φυγοκεντρήστε στις 13.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 °C.Το υπερκείμενο στη συνέχεια επωάστηκε με μαγνητικά σφαιρίδια πρωτεΐνης A+G (Millipore) συζευγμένα με 5 μg αντισώματος anti-PACT (Abeam) ή IgG (CST).Τα σφαιρίδια πλύθηκαν 5 φορές με 5x ρυθμιστικό διάλυμα RIP, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε πέψη με πρωτεϊνάση Κ (NEB).Το RNA εκχυλίστηκε με Trizol και προσδιορίστηκε με RT-qPCR.Οι εκκινητές παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 5.
Η in vitro δοκιμασία RIP πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με ένα τροποποιημένο πρότυπο πρωτόκολλο προσδιορισμού RIP.Συνολικά 5 pmol in vitro μεταγραμμένου RNA αραιώθηκαν 1χ με ρυθμιστικό διάλυμα RIP και ανόπτησαν με επώαση στους 65°C για 5 λεπτά που ακολουθήθηκε από αργή ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου.Συνολικά 5 pmol άθικτων ή μεταλλαγμένων σημασμένων πρωτεϊνών PACT καθαρίστηκαν από Ε. coli.Επωάστε με αναδιαταγμένο RNA για 2 ώρες στους 4°C και ακολουθήστε την παραπάνω διαδικασία για ανάλυση RIP για IP anti-flag.
Για ανάλυση επέκτασης RNA, 1x107 κύτταρα υπέστησαν λύση με ρυθμιστικό διάλυμα 1xRIP.Μετά από φυγοκέντρηση στις 13.000 rpm για 15 λεπτά στους 4°C, το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε προεπεξεργασία με 30 μl μαγνητικών σφαιριδίων στρεπταβιδίνης (Beckman) για 2 ώρες στους 4°C.Το καθαρισμένο κυτταρόλυμα στη συνέχεια τροφοδοτήθηκε με tRNA ζυμομύκητα και επωάστηκε με 40 pmol μετουσιωμένου RNA όλη τη νύχτα στους 4°C, στη συνέχεια για άλλες 2 ώρες και προστέθηκαν 20 μl νέων μαγνητικών σφαιριδίων στρεπταβιδίνης που είχαν αποκλειστεί με BSA.Το στάδιο πλύσης αποτελούνταν από 4 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα RIP 5x και 4 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα RIP 1x.Οι αντίστοιχες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με ρυθμιστικό έκλουσης βιοτίνης (25 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5, 12,5 mM D-βιοτίνη, PMSF) και διαχωρίστηκαν σε NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Μετά από χρώση αργύρου (Beyotime Biotechnology), ορισμένες ταινίες αποκόπηκαν και αναλύθηκαν με MS.
Πραγματοποιήθηκε ανάλυση Co-IP για να ελεγχθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ PACT και PKR.Εν συντομία, τα υπερκείμενα λύματα παρασκευάστηκαν με επώαση 1 χ 107 λυμένων κυττάρων σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα RIP που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στις 13.000 rpm για 15 λεπτά στους 4°C.Τα προϊόντα λύσης φορτώθηκαν με μαγνητικά σφαιρίδια πρωτεΐνης Α + G, συζεύχθηκαν με 5 μ§ αντισώματος αντι-ΡΑΟΤ και περιστράφηκαν ήπια όλη τη νύχτα στους 4°C.Τα σφαιρίδια πλύθηκαν 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα 5×RIP, δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα 1×RIP και εκλούστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα 1×SDS.Η ανακτηθείσα πρωτεΐνη αναλύθηκε με πήκτωμα SDS-PAGE και ανιχνεύθηκε με WB.
Δύο pmol επισημασμένου PACT και 1 pmol PKR καθαρίστηκαν από Ε. coli.Αραιώστε σε ρυθμιστικό διάλυμα 1× RIP και επωάστε με 10 pmol αναδιαταγμένου RNA για 2 ώρες στους 4 °C.Μετά από αυτό, επωάστηκαν με πρωτεΐνη A+G συζευγμένο με μαγνητικά σφαιρίδια αντι-επισημασμένο αντίσωμα για δύο επιπλέον ώρες.Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν τέσσερις φορές με 1χ ρυθμιστικό διάλυμα RIP και εκλούστηκαν με 1χ ρυθμιστικό διάλυμα SDS.Τα προκύπτοντα PACT και PKR ανιχνεύθηκαν από το WB.