Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Οι μέθοδοι ενζυματικής επισήμανσης εγγύτητας που βασίζονται σε ενεργοποιημένους εστέρες ή φαινοξυ ρίζες χρησιμοποιούνται ευρέως για τη χαρτογράφηση υποκυτταρικών πρωτεωμάτων και πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων σε ζωντανά κύτταρα.Ωστόσο, οι ενεργοποιημένοι εστέρες είναι λιγότερο αντιδραστικοί, με αποτέλεσμα μια ευρεία ακτίνα σήμανσης, και οι ρίζες φαινοξυ που παράγονται από την επεξεργασία υπεροξειδίου μπορούν να παρεμβαίνουν στις οδούς οξειδοαναγωγής.Εδώ αναφέρουμε μια μέθοδο φωτοενεργοποίησης εξαρτώμενης από την επισήμανση εγγύτητας που αναπτύχθηκε με τη γενετική σύνδεση της πρωτεΐνης φωτοευαισθητοποιητή miniSOG με μια πρωτεΐνη ενδιαφέροντος.Πυροδοτούμενο από το μπλε φως και ελεγχόμενο από το χρόνο έκθεσης, παράγεται μονό οξυγόνο και στη συνέχεια επιτυγχάνεται χωροχρονικά διαχωρισμένη επισήμανση των υπολειμμάτων ιστιδίνης από τον ανιχνευτή ανιλίνης.Αποδεικνύουμε την υψηλή πιστότητά του μέσω της χαρτογράφησης πρωτεοειδών ειδικά για τα οργανίδια.Μια παράπλευρη σύγκριση του PDPL με το TurboID δείχνει μια πιο συγκεκριμένη και ολοκληρωμένη πρωτεομική κάλυψη του PDPL.Στη συνέχεια, εφαρμόσαμε PDPL στον σχετιζόμενο με τη νόσο μεταγραφικό συνενεργοποιητή BRD4 και E3 Parkin λιγάση και βρήκαμε προηγουμένως άγνωστους αλληλεπιδρώντες.Με διαλογή υπερέκφρασης, δύο άγνωστα υποστρώματα, τα Ssu72 και SNW1, ταυτοποιήθηκαν για το Parkin, του οποίου η αποικοδόμηση προκαλείται από την οδό ουβικουϊτινοποίησης-πρωτεασώματος.
Ο ακριβής χαρακτηρισμός των πρωτεϊνικών δικτύων βασίζεται σε πολλές θεμελιώδεις κυτταρικές διεργασίες.Επομένως, η ιδιαίτερα ακριβής χωροχρονική χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών θα παρέχει μια μοριακή βάση για την αποκρυπτογράφηση βιολογικών οδών, την παθολογία της νόσου και τη διακοπή αυτών των αλληλεπιδράσεων για θεραπευτικούς σκοπούς.Για το σκοπό αυτό, μέθοδοι ικανές να ανιχνεύουν χρονικές αλληλεπιδράσεις σε ζωντανά κύτταρα ή ιστούς είναι πολύ επιθυμητές.Η φασματομετρία μάζας καθαρισμού συγγένειας (AP-MS) έχει χρησιμοποιηθεί ιστορικά για τον εντοπισμό εταίρων δέσμευσης πρωτεϊνών ενδιαφέροντος (POIs).Με την ανάπτυξη μεθόδων ποσοτικής πρωτεϊνικής, δημιουργήθηκε το Bioplex3.0, η μεγαλύτερη βάση δεδομένων πρωτεϊνικών δικτύων που βασίζονται στο AP-MS.Αν και το AP-MS είναι πολύ ισχυρό, τα στάδια λύσης και αραίωσης κυττάρων στη ροή εργασίας στρέφονται προς αδύναμες και παροδικές αλληλεπιδράσεις δέσμευσης και εισάγουν τεχνουργήματα μετά τη λύση, όπως πλαστά ζεύγη αλληλεπίδρασης που στερούνται διαμερισματοποίησης πριν από τη λύση.
Για την αντιμετώπιση αυτών των ζητημάτων, αναπτύχθηκαν αφύσικα αμινοξέα (UAA) με ομάδες διασύνδεσης και πλατφόρμες ενζυμικής κοντινής επισήμανσης (PL) (π.χ. APEX και BioID)5.Παρόλο που η μέθοδος UAA έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε πολλά σενάρια και παρέχει πληροφορίες για άμεσες πρωτεϊνικές κόλλες, εξακολουθεί να απαιτείται βελτιστοποίηση της θέσης εισαγωγής UAA.Το πιο σημαντικό, είναι μια στοιχειομετρική μέθοδος επισήμανσης που στερείται καταλυτικής αντιστροφής των γεγονότων επισήμανσης.Αντίθετα, οι ενζυματικές μέθοδοι PL, όπως η μέθοδος BioID, συντήκουν την τροποποιημένη λιγάση βιοτίνης με την POI7, η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί τη βιοτίνη για να σχηματίσει ένα αντιδραστικό ενδιάμεσο εστέρα βιοτινυλ-ΑΜΡ.Το ένζυμο έτσι καταλύει και απελευθερώνει ένα «σύννεφο» ενεργοποιημένης βιοτίνης που επισημαίνει τα εγγύς υπολείμματα λυσίνης.Ωστόσο, το BioID απαιτεί περισσότερες από 12 ώρες για να ληφθεί ένα επαρκές σήμα με ετικέτα, το οποίο αποκλείει τη χρήση του με χρονική ανάλυση.Χρησιμοποιώντας την κατευθυνόμενη εξέλιξη που βασίζεται στην οθόνη ζύμης, το TurboID σχεδιάστηκε με βάση το BioID για να είναι πιο αποτελεσματικό, επιτρέποντας την αποτελεσματική επισήμανση με βιοτίνη εντός 10 λεπτών, επιτρέποντας τη μελέτη πιο δυναμικών διεργασιών.Επειδή το TurboID είναι πολύ ενεργό και τα επίπεδα ενδογενούς βιοτίνης επαρκούν για τη σήμανση χαμηλού επιπέδου, η επισήμανση υποβάθρου γίνεται πιθανό πρόβλημα όταν απαιτείται ιδιαίτερα ενισχυμένη και χρονισμένη επισήμανση με την προσθήκη εξωγενούς βιοτίνης.Επιπλέον, οι ενεργοποιημένοι εστέρες είναι ελάχιστα αντιδραστικοί (t1/2 ~5 min), γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε μεγάλη ακτίνα σήμανσης, ειδικά μετά από κορεσμό γειτονικών πρωτεϊνών με βιοτίνη 5. Σε μια άλλη προσέγγιση, η γενετική σύντηξη της τροποποιημένης ασκορβικής υπεροξειδάσης (δηλ. βιοτίνη- ρίζες φαινόλης και επιτρέπει την επισήμανση πρωτεϊνών εντός ενός λεπτού9,10. Το APEX χρησιμοποιείται ευρέως για την αναγνώριση υποκυτταρικών πρωτεϊνών, συμπλεγμάτων πρωτεϊνών μεμβράνης και συμπλεγμάτων πρωτεΐνης σηματοδότησης κυτοσολίου11,12. Ωστόσο, η ανάγκη για υψηλές συγκεντρώσεις υπεροξειδίων μπορεί να επηρεάσει τις πρωτεΐνες οξειδοαναγωγής ή τις οδούς, διαταράσσοντας κυτταρικές διεργασίες.
Έτσι, μια νέα μέθοδος ικανή να παράγει πιο αντιδραστικά είδη καταστολής με επισήμανση ακτίνας με υψηλή χωρική και χρονική ακρίβεια χωρίς να διαταράσσει σημαντικά τις κυτταρικές οδούς θα είναι μια σημαντική προσθήκη στις υπάρχουσες μεθόδους. Μεταξύ των αντιδρώντων ειδών, το μονό οξυγόνο κέντρισε την προσοχή μας λόγω της μικρής διάρκειας ζωής και της περιορισμένης ακτίνας διάχυσης (t1/2 < 0,6 μs στα κύτταρα)13. Μεταξύ των αντιδρώντων ειδών, το μονό οξυγόνο κέντρισε την προσοχή μας λόγω της μικρής διάρκειας ζωής και της περιορισμένης ακτίνας διάχυσης (t1/2 < 0,6 μs στα κύτταρα)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и περιορισμένες радиуса διαφοροποιήσεις (t1/2 < 0,6 mx в клетках)13. Μεταξύ των ενεργών μορφών, το μονό οξυγόνο τράβηξε την προσοχή μας λόγω της μικρής διάρκειας ζωής και της περιορισμένης ακτίνας διάχυσης (t1/2 < 0,6 μs στα κύτταρα)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中有限（细胞中摑t1/2、氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中摑t1/2〵中我瀻而而3５ 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и περιορισμένο радиуса διαφοροποιήσεις (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Μεταξύ των ενεργών μορφών, το μονό οξυγόνο προσελκύει την προσοχή μας λόγω της μικρής διάρκειας ζωής του και της περιορισμένης ακτίνας διάχυσης (t1/2 < 0,6 μs στα κύτταρα).Το απλό οξυγόνο έχει αναφερθεί ότι οξειδώνει τυχαία τη μεθειονίνη, την τυροσίνη, την ιστιδίνη και την τρυπτοφάνη, καθιστώντας το πολικό 14,15 για προσκόλληση σε ανιχνευτές με βάση την αμίνη ή τη θειόλη16,17.Αν και το μονό οξυγόνο έχει χρησιμοποιηθεί για την επισήμανση του υποκυτταρικού διαμερίσματος RNA, οι στρατηγικές για την επαναχρησιμοποίηση των ενδογενών δεικτών εγγύτητας POI παραμένουν ανεξερεύνητες.Εδώ, παρουσιάζουμε μια πλατφόρμα που ονομάζεται photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), όπου χρησιμοποιούμε το μπλε φως για να φωτίσουμε POI συγχωνευμένα με φωτοευαισθητοποιητή miniSOG και να ενεργοποιήσουμε την παραγωγή μονήρους οξυγόνου για την οξείδωση εγγύς υπολειμμάτων, ακολουθούμενες από τροποποιήσεις που περιέχουν αμίνες για την οξείδωση των χημικών ανιχνευτών σε ενδιάμεσα ζωντανά κύτταρα..Δοκιμάσαμε μια ομάδα χημικών ανιχνευτών για να μεγιστοποιήσουμε την εξειδίκευση της ετικέτας και προσδιορίσαμε τοποθεσίες τροποποίησης χρησιμοποιώντας μια ανοιχτή ροή εργασιών πρωτεϊνικής.Μια παράπλευρη σύγκριση του PDPL με το TurboID δείχνει μια πιο συγκεκριμένη και ολοκληρωμένη πρωτεομική κάλυψη του PDPL.Εφαρμόσαμε αυτή την προσέγγιση σε δείκτες ειδικών οργανιδίων του υποκυτταρικού πρωτεώματος και γενικής αναγνώρισης πρωτεϊνικών εταίρων δέσμευσης για τη σχετιζόμενη με τον καρκίνο επιγενετική ρυθμιστική πρωτεΐνη BRD4 και τη σχετιζόμενη με τη νόσο του Πάρκινσον Ε3 λιγάση Parkin, που επιβεβαίωσαν τόσο ένα γνωστό όσο και ένα άγνωστο δίκτυο πρωτεΐνης αλληλεπιδράσεις..Η ικανότητα του PDPL να αναγνωρίζει υποστρώματα Ε3 σε μεγάλα πρωτεϊνικά σύμπλοκα αντιπροσωπεύει μια κατάσταση όπου απαιτείται η αναγνώριση των έμμεσων συνδετικών.Δύο άγνωστα υποστρώματα parkin που διαμεσολαβούνται από ουμπικουϊτινοποίηση-πρωτεάσωμα έχουν επιβεβαιωθεί in situ.
Η φωτοδυναμική θεραπεία (PDT)19 και η αδρανοποίηση με λέιζερ υποβοηθούμενη από χρωμοφόρο (CALI)20, στην οποία η ακτινοβολία φωτός με φωτοευαισθητοποιητές παράγει μονό οξυγόνο, μπορεί να απενεργοποιήσει τις πρωτεΐνες-στόχους ή να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο.Δεδομένου ότι το απλό οξυγόνο είναι μια εξαιρετικά δραστική ουσία με θεωρητική απόσταση διάχυσης περίπου 70 nm, η χωρικά περιορισμένη οξείδωση γύρω από τον φωτοευαισθητοποιητή μπορεί να ελεγχθεί.Με βάση αυτή την ιδέα, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε μονό οξυγόνο για να επιτύχουμε στενή σήμανση συμπλεγμάτων πρωτεϊνών σε ζωντανά κύτταρα.Έχουμε αναπτύξει μια χημειοπρωτεωμική προσέγγιση PDPL για την εκπλήρωση τεσσάρων λειτουργιών: (1) να καταλύει την παραγωγή ενεργού μονήρους οξυγόνου παρόμοιου με την ενζυματική προσέγγιση PL.(2) παρέχει επισήμανση με χρονική επίλυση κατά την έναρξη του φωτός.(3) με τροποποίηση (4) Αποφύγετε τη χρήση ενδογενών συμπαραγόντων (όπως η βιοτίνη) για να μειώσετε το υπόβαθρο ή χρησιμοποιήστε εξαιρετικά ενοχλητικά εξωγενή αντιδραστήρια (όπως υπεροξείδια) για να ελαχιστοποιήσετε την έκθεση των κυττάρων στο περιβαλλοντικό στρες.
Οι φωτοευαισθητοποιητές μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες, συμπεριλαμβανομένων φθοροφόρων μικρού μοριακού βάρους (π.χ. τριαντάφυλλο της Βεγγάλης, μπλε του μεθυλενίου)22 και γενετικά κωδικοποιημένες μικρές πρωτεΐνες (π.χ. miniSOG, KillerRed)23.Για να επιτύχουμε έναν αρθρωτό σχεδιασμό, αναπτύξαμε την πλατφόρμα PDPL πρώτης γενιάς προσθέτοντας πρωτεΐνες φωτοευαισθητοποιητή (PS) στο POI24,25 (Εικόνα 1α).Όταν ακτινοβολείται με μπλε φως, το μονό οξυγόνο οξειδώνει τα εγγύς πυρηνόφιλα υπολείμματα αμινοξέων, με αποτέλεσμα μια πολικότητα που είναι ηλεκτροφιλική και μπορεί περαιτέρω να αντιδράσει με πυρηνόφιλα ιχνηλάτη αμίνης16,17.Ο ανιχνευτής έχει σχεδιαστεί με λαβή αλκυνίου για να επιτρέπει τη χημεία των κλικ και την έλξη προς τα κάτω για χαρακτηρισμό LC/MS/MS.
Σχηματική απεικόνιση της επισήμανσης συμπλεγμάτων πρωτεϊνών με τη μεσολάβηση miniSOG.Όταν εκτίθενται στο μπλε φως, τα κύτταρα που εκφράζουν miniSOG-POI παράγουν μονό οξυγόνο, το οποίο τροποποιεί τις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν αλλά όχι τις μη δεσμευτικές πρωτεΐνες.Τα ενδιάμεσα προϊόντα φωτοοξείδωσης παρεμποδίζονται από ετικέτες αναμετάδοσης του χημικού ανιχνευτή αμίνης για να σχηματίσουν ομοιοπολικά προϊόντα προσθήκης.Η ομάδα αλκυνυλίου στον ανιχνευτή χημείας επιτρέπει τη χημεία κλικ για εμπλουτισμό με pull-down ακολουθούμενη από ποσοτικοποίηση LC-MS/MS.β Χημική δομή ανιχνευτών αμίνης 1-4.γ Αντιπροσωπευτική ανάλυση φθορίζοντος πηκτώματος μιτοχονδριακών εντοπισμένων πρωτεομικών δεικτών με τη μεσολάβηση miniSOG χρησιμοποιώντας ανιχνευτές 1-4 και σχετική ποσοτικοποίηση με βάση την πυκνομετρία γέλης.Η αναλογία σήματος προς υπόβαθρο των χημικών ανιχνευτών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας πειράματα αρνητικού ελέγχου, εξαιρουμένου του μπλε φωτός ή χρησιμοποιώντας κύτταρα HEK293T χωρίς έκφραση miniSOG.n = 2 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα.Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει ένα βιολογικό αντίγραφο.δ Αντιπροσωπευτική ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του PDPL χρησιμοποιώντας βελτιστοποιημένο ανιχνευτή 3 παρουσία ή απουσία των υποδεικνυόμενων συστατικών PDPL όπως c.n = 3 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα.Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει ένα βιολογικό αντίγραφο.Οι κεντρικές γραμμές και τα μουστάκια αντιπροσωπεύουν τη μέση και ± τυπική απόκλιση.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Συνεστιακή απεικόνιση απλού οξυγόνου με μακρυά κόκκινη χρώση Si-DMA.Μπάρα κλίμακας: 10 μm.Τα πειράματα απεικόνισης γέλης και ομοεστιακά επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.
Αρχικά δοκιμάσαμε την ικανότητα των ώριμων φωτοευαισθητοποιητών miniSOG26 και KillerRed23, που εκφράζονται σταθερά σε HEK293T, να μεσολαβούν στην επισήμανση προπαργυλαμίνης του πρωτεώματος ως χημικού ανιχνευτή (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α).Η ανάλυση φθορισμού γέλης έδειξε ότι η επισήμανση ολόκληρου του πρωτεώματος επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας miniSOG και ακτινοβολία μπλε φωτός, ενώ δεν παρατηρήθηκε προϊόν ορατού σήμανσης με το KillerRed.Για να βελτιώσουμε την αναλογία σήματος προς φόντο, στη συνέχεια δοκιμάσαμε ένα σύνολο χημικών ανιχνευτών που περιέχουν ανιλίνη (1 και 3), προπυλαμίνη (2) ή βενζυλαμίνη (4).Παρατηρήσαμε ότι τα ίδια τα κύτταρα HEK293T είχαν υψηλότερο σήμα υποβάθρου σε σύγκριση με το μηδενικό μπλε φως, πιθανώς λόγω του ενδογενούς φωτοευαισθητοποιητή ριβοφλαβίνης, το μονονουκλεοτίδιο φλαβίνης (FMN) 27 . Οι χημικοί ανιχνευτές 1 και 3 με βάση την ανιλίνη έδωσαν καλύτερη εξειδίκευση, με το HEK293T να εκφράζει σταθερά miniSOG στα μιτοχόνδρια να εμφανίζει >8 φορές αύξηση στο σήμα για τον ανιχνευτή 3, ενώ ο ανιχνευτής 2 που χρησιμοποιείται στη μέθοδο επισήμανσης RNA CAP-seq εμφανίζει μόνο ~2,5- διπλάσια αύξηση του σήματος, πιθανόν λόγω διαφορετικών προτιμήσεων αντιδραστικότητας μεταξύ RNA και πρωτεΐνης (Εικ. 1b, c). Οι χημικοί ανιχνευτές 1 και 3 με βάση την ανιλίνη έδωσαν καλύτερη εξειδίκευση, με το HEK293T να εκφράζει σταθερά miniSOG στα μιτοχόνδρια να εμφανίζει >8 φορές αύξηση στο σήμα για τον ανιχνευτή 3, ενώ ο ανιχνευτής 2 που χρησιμοποιείται στη μέθοδο επισήμανσης RNA CAP-seq εμφανίζει μόνο ~2,5- διπλάσια αύξηση του σήματος, πιθανόν λόγω διαφορετικών προτιμήσεων αντιδραστικότητας μεταξύ RNA και πρωτεΐνης (Εικ. 1b, c).Οι χημικοί ανιχνευτές 1 και 3 με βάση την ανιλίνη έδειξαν καλύτερη εξειδίκευση: το HEK293T, το οποίο εκφράζει σταθερά το miniSOG στα μιτοχόνδρια, εμφανίζει μεγαλύτερη από 8 φορές αύξηση στο σήμα για τον ανιχνευτή 3, ενώ ο ανιχνευτής 2, που χρησιμοποιείται στη μέθοδο επισήμανσης CAP-seq RNA, μόνο δείχνει ~ 2,5 φορές αύξηση σήματος, πιθανώς λόγω διαφορετικών προτιμήσεων αντιδραστικότητας μεταξύ RNA και πρωτεΐνης (Εικ. 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAΟι χημικοί ανιχνευτές 1 και 3 με βάση την ανιλίνη είχαν καλύτερη εξειδίκευση, το HEK293T εξέφραζε σταθερά miniSOG στα μιτοχόνδρια και ο ανιχνευτής 3 είχε πάνω από 8 φορές αύξηση στο σήμα, ενώ ο ανιχνευτής 2 για τη μέθοδο επισήμανσης CAP-seq RNA έδειξε μόνο ~2,5 φορές αύξηση.στο σήμα, πιθανώς λόγω διαφορετικών προτιμήσεων αντίδρασης μεταξύ RNA και πρωτεΐνης (Εικ. 1β, γ).Επιπλέον, δοκιμάστηκαν ισομερή ανιχνευτή 3 και ανιχνευτές υδραζίνης (ανιχνευτές 5, 6, 7), επιβεβαιώνοντας τη βελτιστοποίηση του ανιχνευτή 3 (Συμπληρωματικό Σχήμα 1b,c).Ομοίως, η ανάλυση φθορισμού σε γέλη αποκάλυψε άλλες βελτιστοποιημένες πειραματικές παραμέτρους: μήκος κύματος ακτινοβολίας (460 nm), συγκέντρωση χημικού ανιχνευτή (1 mM) και χρόνο ακτινοβολίας (20 λεπτά) (Συμπληρωματικό Σχήμα 2a–c).Η παράλειψη οποιουδήποτε στοιχείου ή βήματος στο πρωτόκολλο PDPL είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αναστροφή του σήματος στο παρασκήνιο (Εικ. 1δ).Σημειωτέον, η σήμανση πρωτεϊνών μειώθηκε σημαντικά παρουσία αζιδίου του νατρίου ή trolox, τα οποία είναι γνωστό ότι σβήνουν το μονό οξυγόνο.Η παρουσία του D2O, το οποίο είναι γνωστό ότι σταθεροποιεί το μονό οξυγόνο, ενισχύει το σήμα σήμανσης.Για να διερευνηθεί η συμβολή άλλων δραστικών ειδών οξυγόνου στην επισήμανση, προστέθηκαν μαννιτόλη και βιταμίνη C για να δημιουργηθούν καθαριστές ριζών υδροξυλίου και υπεροξειδίου, αντίστοιχα, 18, 29, αλλά δεν βρέθηκε ότι μειώνουν την επισήμανση.Η προσθήκη H2O2, αλλά όχι ο φωτισμός, δεν οδήγησε σε επισήμανση (Συμπληρωματικό Σχήμα 3α).Η απλή απεικόνιση οξυγόνου φθορισμού με ανιχνευτές Si-DMA επιβεβαίωσε την παρουσία μονήρους οξυγόνου στο καλώδιο HEK293T-miniSOG, αλλά όχι στο αρχικό καλώδιο HEK293T.Επιπλέον, το mitoSOX Red δεν μπόρεσε να ανιχνεύσει την παραγωγή υπεροξειδίου μετά τον φωτισμό (Εικ. 1ε και Συμπληρωματικό Σχήμα 3β) 30. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι το μονό οξυγόνο είναι το κύριο αντιδραστικό είδος οξυγόνου που είναι υπεύθυνο για την επακόλουθη πρωτεομική σήμανση.Η κυτταροτοξικότητα του PDPL αξιολογήθηκε συμπεριλαμβανομένης της ακτινοβολίας μπλε φωτός και των χημικών ανιχνευτών, και δεν παρατηρήθηκε σημαντική κυτταροτοξικότητα (Συμπληρωματικό Σχήμα 4α).
Προκειμένου να μελετήσουμε τον μηχανισμό επισήμανσης και να καταστεί δυνατή η πρωτεομική ταυτοποίηση συμπλεγμάτων πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας LC-MS/MS, πρέπει πρώτα να προσδιορίσουμε ποια αμινοξέα τροποποιούνται και τη μάζα δέλτα των επισημάνσεων ανιχνευτή.Η μεθειονίνη, η ιστιδίνη, η τρυπτοφάνη και η τυροσίνη έχουν αναφερθεί ότι τροποποιούνται από το απλό οξυγόνο14,15.Ενσωματώνουμε τη ροή εργασιών TOP-ABPP31 με την αμερόληπτη ανοιχτή αναζήτηση που παρέχεται από την υπολογιστική πλατφόρμα FragPipe που βασίζεται στο MSFragger32.Μετά την τροποποίηση μονήρους οξυγόνου και την επισήμανση χημικού ανιχνευτή, η χημεία κλικ πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ετικέτα μείωσης βιοτίνης που περιέχει έναν διασπάσιμο συνδέτη, ακολουθούμενη από τέντωμα νετραβιδίνης και πέψη με θρυψίνη.Το τροποποιημένο πεπτίδιο, ακόμα συνδεδεμένο με τη ρητίνη, φωτοδιάσπασε για ανάλυση LC-MS/MS (Εικόνα 2α και Συμπληρωματικά Δεδομένα 1).Ένας μεγάλος αριθμός τροποποιήσεων συνέβη σε όλο το πρωτεόμιο με πάνω από 50 αντιστοιχίσεις χαρτών πεπτιδίου (PSM) που αναφέρονται (Εικ. 2b).Παραδόξως, παρατηρήσαμε μόνο τροποποίηση της ιστιδίνης, πιθανώς λόγω της υψηλότερης αντιδραστικότητας της οξειδωμένης ιστιδίνης προς τους ανιχνευτές ανιλίνης από άλλα αμινοξέα.Σύμφωνα με τον δημοσιευμένο μηχανισμό της οξείδωσης της ιστιδίνης από το απλό οξυγόνο,21,33 η προτεινόμενη δομή δέλτα-μάζας +229 Da αντιστοιχεί στην προσθήκη του ανιχνευτή 3 με 2-οξο-ιστιδίνη μετά από δύο οξειδώσεις, ενώ το +247 Da είναι το προϊόν υδρόλυσης του +229 Da (Συμπληρωματικό Σχ. 5).Η αξιολόγηση του φάσματος MS2 έδειξε υψηλή αξιοπιστία αναγνώρισης των περισσότερων ιόντων y και b, συμπεριλαμβανομένης της ταυτοποίησης τροποποιημένων ιόντων θραυσμάτων (y και b) (Εικ. 2c).Η ανάλυση περιβάλλοντος της τοπικής αλληλουχίας των τροποποιημένων με PDPL ιστιδινών αποκάλυψε μια μέτρια προτίμηση μοτίβου για μικρά υδρόφοβα υπολείμματα σε θέσεις ±1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 4b).Κατά μέσο όρο, ταυτοποιήθηκαν 1,4 ιστιδίνες ανά πρωτεΐνη και οι θέσεις αυτών των δεικτών προσδιορίστηκαν με ανάλυση προσβάσιμης επιφάνειας σε διαλύτη (SASA) και σχετικής διαθεσιμότητας διαλύτη (RSA) (Συμπληρωματικό Σχήμα 4c,d).
Μια αμερόληπτη ροή εργασίας για τη μελέτη της υπολειπόμενης επιλεκτικότητας χρησιμοποιώντας την υπολογιστική πλατφόρμα FragPipe που υποστηρίζεται από το MSFragger.Οι διασπάσιμοι συνδέτες χρησιμοποιούνται στη χημεία Click για να επιτρέπεται η φωτοδιάσπαση τροποποιημένων πεπτιδίων από ρητίνη στρεπταβιδίνης.Ξεκίνησε μια ανοιχτή αναζήτηση για τον εντοπισμό πολυάριθμων τροποποιήσεων, καθώς και σχετικών υπολειμμάτων.β Εκχωρήστε τη μάζα των τροποποιήσεων που συμβαίνουν σε όλο το πρωτεόμιο.Πεπτιδική χαρτογράφηση PSM.c Φασματικός σχολιασμός MS2 των θέσεων ιστιδίνης που τροποποιήθηκαν με τον ανιχνευτή 3. Ως αντιπροσωπευτικό παράδειγμα, μια ομοιοπολική αντίδραση με τον ανιχνευτή 3 πρόσθεσε +229,0938 Da στο τροποποιημένο αμινοξύ.d Δοκιμασία μετάλλαξης που χρησιμοποιείται για τον έλεγχο των δεικτών PDPL.Τα PRDX3 (H155A, H225A) και PRDX1 (H10A, H81A, H169A) επιμολύνθηκαν με πλασμίδια άγριου τύπου για ανίχνευση αντι-Flag.e Το συνθετικό πεπτίδιο αντέδρασε με καθαρισμένο miniSOG παρουσία ανιχνευτή 3 και τα αντίστοιχα προϊόντα με Δm +247 και +229 σημειώθηκαν στο φάσμα LC-MS.f Αλληλεπιδράσεις in vitro πρωτεΐνης προς πρωτεΐνη που διαμορφώθηκαν με αντίσωμα miniSOG-6xHis-tag και anti-6xHis.Αντιβιοτίνη (στρεπταβιδίνη-HRP) και ανάλυση Western blot κατά ποντικού συμπλεγμάτων αντισωμάτων miniSOG-6xHis/anti-6xHis που έχουν επισημανθεί με τον ανιχνευτή 3, ανάλογα με το χρόνο έκθεσης στο φως.Οι ετικέτες για μεμονωμένες πρωτεΐνες εκφράζονται στο αντίστοιχο μοριακό βάρος: ελαφριά αλυσίδα αντισώματος LC, βαριά αλυσίδα αντισώματος HC.Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.
Για βιοχημική επαλήθευση της θέσης επισήμανσης, τα PRDX3 και PRDX1 που ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας άλλαξαν από ιστιδίνη σε αλανίνη και συγκρίθηκαν με φυσικού τύπου σε προσδιορισμούς επιμόλυνσης.Τα αποτελέσματα PDPL έδειξαν ότι η μετάλλαξη μείωσε σημαντικά την επισήμανση (Εικ. 2δ).Εν τω μεταξύ, οι πεπτιδικές αλληλουχίες που ταυτοποιήθηκαν στην ανοιχτή αναζήτηση συντέθηκαν και αντέδρασαν in vitro με καθαρισμένο miniSOG παρουσία ανιχνευτή 3 και μπλε φωτός, δίδοντας προϊόντα με μετατόπιση μάζας +247 και +229 Da όταν ανιχνεύθηκαν με LC-MS (Εικ. . 2e).).Για να ελέγξουμε εάν οι εγγύς πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν θα μπορούσαν να επισημανθούν in vitro ως απόκριση στη φωτοενεργοποίηση miniSOG, σχεδιάσαμε μια τεχνητή δοκιμασία εγγύτητας με αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης miniSOG-6xHis και ενός μονοκλωνικού αντισώματος αντι-His in vitro (Εικόνα 2στ).Σε αυτή τη δοκιμασία, αναμέναμε εγγύς επισήμανση των βαριών και ελαφρών αλυσίδων αντισωμάτων με miniSOG.Πράγματι, οι κηλίδες Western κατά ποντικού (αναγνωρίζοντας τις βαριές και ελαφριές αλυσίδες αντισώματος επισημασμένου με αντι-6xHis) και στυπώματα στρεπταβιδίνης έδειξαν ισχυρή βιοτινυλίωση της βαριάς και της ελαφριάς αλυσίδας.Σημειωτέον, παρατηρήσαμε αυτοβιοτινυλίωση miniSOG λόγω της ετικέτας 6xHis και των διασυνδέσεων μεταξύ ελαφρών και βαριών αλυσίδων, που μπορεί να σχετίζονται με το προηγουμένως περιγραφόμενο χάσμα μεταξύ της εγγύς απόκρισης λυσίνης και 2-οξο-ιστιδίνης.Συμπερασματικά, συμπεραίνουμε ότι το PDPL τροποποιεί την ιστιδίνη με τρόπο που εξαρτάται από την εγγύτητα.
Ο επόμενος στόχος μας ήταν να χαρακτηρίσουμε το υποκυτταρικό πρωτεώμα για να ελέγξουμε την ειδικότητα της in situ επισήμανσης.Επομένως, εκφράσαμε σταθερά miniSOG στον πυρήνα, τη μιτοχονδριακή μήτρα ή την εξωτερική μεμβράνη ER των κυττάρων HEK293T (Εικ. 3α).Η ανάλυση φθορισμού γέλης αποκάλυψε άφθονες επισημασμένες ζώνες σε τρεις υποκυτταρικές θέσεις καθώς και διαφορετικά μοτίβα σήμανσης (Εικ. 3β).Η ανάλυση απεικόνισης φθορισμού έδειξε υψηλή ειδικότητα του PDPL (Εικ. 3γ).Η ροή εργασίας PDPL ακολουθήθηκε από αντιδράσεις κλικ με βαφές ροδαμίνης για να οριοθετηθούν υποκυτταρικά πρωτεώματα χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού και τα σήματα PDPL εντοπίστηκαν με DAPI, μιτοχονδριακούς ιχνηλάτες ή ιχνηλάτες ER, επιβεβαιώνοντας την υψηλή πιστότητα του PDPL.Για τις τρεις θέσεις οργανιδίων, μια παράπλευρη σύγκριση του PDPL με το TurboID χρησιμοποιώντας στύπωμα western αβιδίνης έδειξε ότι το PDPL επισημάνθηκε πιο συγκεκριμένα σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους.Υπό συνθήκες PDPL, εμφανίστηκαν περισσότερες επισημασμένες ζώνες, υποδεικνύοντας περισσότερες σημασμένες με PDPL πρωτεΐνες (Συμπληρωματικό Σχήμα 6a-d).
μια Σχηματική αναπαράσταση της επισήμανσης πρωτεώματος που προκαλείται από miniSOG.Το miniSOG στοχεύει τη μιτοχονδριακή μήτρα μέσω σύντηξης με τα Ν-τερματικά 23 αμινοξέα του ανθρώπινου COX4 (mito-miniSOG), τον πυρήνα μέσω σύντηξης στο H2B (πυρήνας-miniSOG) και το Sec61β μέσω της κυτταροπλασματικής πλευράς της μεμβράνης ER (ER-miniSOG ).Οι ενδείξεις περιλαμβάνουν απεικόνιση γέλης, ομοεστιακή απεικόνιση και φασματομετρία μάζας.β Αντιπροσωπευτικές εικόνες γέλης τριών προφίλ PDPL ειδικά για οργανίδια.CBB Coomassie Brilliant Blue.γ Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές εικόνες κυττάρων HEK293T που εκφράζουν σταθερά miniSOG με διαφορετικούς υποκυτταρικούς εντοπισμούς που ανιχνεύονται από αντίσωμα επισημασμένο V5 (κόκκινο).Οι υποκυτταρικοί δείκτες χρησιμοποιούνται για τα μιτοχόνδρια και το ER (πράσινο).Η ροή εργασίας PDPL περιλαμβάνει την ανίχνευση υποκυτταρικών πρωτεωμάτων με σήμανση miniSOG (κίτρινο) χρησιμοποιώντας χημεία κλικ Cy3-αζιδίου.Μπάρα κλίμακας: 10 μm.d Ηφαιστειακά διαγράμματα πρωτεωμάτων με επισήμανση PDPL σε διάφορα οργανίδια ποσοτικοποιημένα με μη επισημασμένη ποσοτικοποίηση (n = 3 ανεξάρτητα βιολογικά πειράματα).Το τεστ t Student δύο ουρών χρησιμοποιήθηκε σε ηφαίστεια.Ως αρνητικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε άγριος τύπος HEK293T. Σημαντικά αλλαγμένες πρωτεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο (p < 0,05 και >2 φορές διαφορά έντασης ιόντων). Σημαντικά αλλαγμένες πρωτεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο (p < 0,05 και >2 φορές διαφορά έντασης ιόντων). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интензивности јонов). Σημαντικά τροποποιημένες πρωτεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο (p < 0,05 και >2 φορές διαφορά στην ένταση ιόντων).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в јоной силе). Σημαντικά τροποποιημένες πρωτεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο (p < 0,05 και > 2 φορές διαφορά στην ιοντική ισχύ).Οι σχετικές πρωτεΐνες σημαντικές για το HEK293T-miniSOG αλλά όχι σημαντικές για το HEK293T εμφανίζονται με πράσινο χρώμα.e Ανάλυση της ειδικότητας των πρωτεομικών συνόλων δεδομένων από πειράματα d.Ο συνολικός αριθμός των στατιστικά σημαντικών πρωτεϊνών σε κάθε οργανίδιο (κόκκινες και πράσινες κουκκίδες) σημειώνεται στην κορυφή.Τα ιστογράμματα δείχνουν πρωτεΐνες εντοπισμένες σε οργανίδια με βάση το MitoCarta 3.0, την ανάλυση GO και τους A. Ting et al.Ανθρωποι.Ξεχωριστά σύνολα δεδομένων για μιτοχόνδρια, πυρήνες και ER.Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα παρέχονται με τη μορφή αρχείων πρωτογενών δεδομένων.
Με ενθάρρυνση από τα αποτελέσματα της γέλης και της απεικόνισης, χρησιμοποιήθηκε ποσοτικοποίηση χωρίς ετικέτα για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αναγνωρισμένου πρωτεώματος σε κάθε οργανίδιο (Συμπληρωματικά Δεδομένα 2).Το μη επιμολυσμένο HEK293T χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος για την αφαίρεση δεικτών υποβάθρου. Η ανάλυση διαγράμματος ηφαιστείου εμφάνισε σημαντικά εμπλουτισμένες πρωτεΐνες (p < 0,05 και >2-πλάσια ένταση ιόντων) καθώς και πρωτεΐνες μονήρους που υπάρχουν μόνο σε γραμμές που εκφράζουν miniSOG (Εικ. 3d κόκκινες και πράσινες κουκκίδες). Η ανάλυση διαγράμματος ηφαιστείου εμφάνισε σημαντικά εμπλουτισμένες πρωτεΐνες (p < 0,05 και >2-πλάσια ένταση ιόντων) καθώς και πρωτεΐνες μονήρους που υπάρχουν μόνο σε γραμμές που εκφράζουν miniSOG (Εικ. 3d κόκκινες και πράσινες κουκκίδες). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, эрисыю3. Η ανάλυση διαγράμματος ηφαιστείου έδειξε σημαντικά εμπλουτισμένες πρωτεΐνες (p<0,05 και >2-πλάσια ένταση ιόντων) καθώς και μεμονωμένες πρωτεΐνες που υπάρχουν μόνο σε γραμμές που εκφράζουν miniSOG (Εικ. 3d, κόκκινες και πράσινες κουκκίδες).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 蛋白质 存 在于 在于 在于 表达 系 中 中 的 的 单一 单一 仅 存 在于 在于 表达 系 中 中 的 的 单一 单一 蛋白质 图 存 在于 表达 系 系 中 的 的 的 单一 单一 仅 存 存 在于 表达 系 中 中 的 的 单一 单一 蛋白质 仅 存 在于 表达 表达 系 中 中 的 的 单一 ς火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 και> 2x ionnaя сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красы3). Η ανάλυση γραφικής παράστασης ηφαιστείου αποκάλυψε σημαντικά εμπλουτισμένες πρωτεΐνες (ρ<0,05 και >2x ιοντική ισχύ) καθώς και μεμονωμένες πρωτεΐνες που υπάρχουν μόνο στη γραμμή έκφρασης miniSOG (κόκκινες και πράσινες κουκκίδες στο Σχήμα 3δ).Συνδυάζοντας αυτά τα δεδομένα, εντοπίσαμε 1364, 461 και 911 στατιστικά σημαντικές πρωτεΐνες πυρηνικής, μιτοχονδριακής και ER εξωτερικής μεμβράνης, αντίστοιχα.Για να αναλύσουμε την ακρίβεια του εντοπισμένου με οργανίδια PDPL, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) και A. Ting et al.χρησιμοποιήθηκε ένα σύνολο δεδομένων8 για τα μιτοχόνδρια, τον πυρήνα και το ER για να ελεγχθεί η ειδικότητα των οργανιδίων των ανιχνευόμενων πρωτεϊνών, που αντιστοιχεί σε ακρίβεια 73,4, 78,5 και 73,0% (Εικ. 3e).Η εξειδίκευση του PDPL επιβεβαιώνει ότι το PDPL είναι ένα ιδανικό εργαλείο για την αναγνώριση πρωτεωμάτων ειδικών για τα οργανίδια.Συγκεκριμένα, η υποχονδριακή ανάλυση ταυτοποιημένων μιτοχονδριακών πρωτεϊνών έδειξε ότι το παγιδευμένο πρωτεϊνό κατανεμήθηκε κυρίως στη μήτρα και την εσωτερική μεμβράνη (226 και 106, αντίστοιχα), αντιπροσωπεύοντας το 91,7% (362) του συνολικού αριθμού ταυτοποιημένων μιτοχονδριακών πρωτεϊνών.επιβεβαιώθηκε επιπλέον υψηλό επίπεδο PDPL (Συμπληρωματικό Σχ. 7α).Παρομοίως, η υποπυρηνική ανάλυση έδειξε ότι το συλλαμβανόμενο πρωτεόμιο κατανεμήθηκε κυρίως στον πυρήνα, το πυρηνόπλασμα και τον πυρήνα (Συμπληρωματικό Σχ. 7β).Η πυρηνική πρωτεομική ανάλυση με ένα πεπτίδιο σήματος πυρηνικού εντοπισμού (3xNLS) έδειξε παρόμοια ακρίβεια με το κατασκεύασμα H2B (Συμπληρωματικό Σχήμα 7c–h).Για να προσδιοριστεί η ειδικότητα του δείκτη PDPL, η πυρηνική λαμινίνη Α επιλέχθηκε ως μια πιο διακριτά εντοπισμένη παγίδα POI7.Το PDPL αναγνώρισε 36 σημαντικά εμπλουτισμένες πρωτεΐνες, από τις οποίες 12 πρωτεΐνες (30,0% συμπεριλαμβανομένης της λαμίνης Α) ήταν καλά χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες αλληλεπιδρώντων με λαμινό Α που σχολιάστηκαν από τη βάση δεδομένων String, με υψηλότερο ποσοστό από τη μέθοδο BioID (122 πρωτεΐνες) 28 από 28. , 22,9 %) 7. Η μέθοδός μας εντόπισε λιγότερες πρωτεΐνες, πιθανώς λόγω περιορισμένων περιοχών σήμανσης, κάτι που κατέστη δυνατό χάρη στο πιο ενεργό μονό οξυγόνο.Η ανάλυση GO έδειξε ότι οι ταυτοποιημένες πρωτεΐνες εντοπίστηκαν κυρίως στο νουκλεόπλασμα (26), στην πυρηνική μεμβράνη (10), στην πυρηνική μεμβράνη (9) και στους πυρηνικούς πόρους (5).Συλλογικά, αυτές οι πυρηνικά εντοπισμένες πρωτεΐνες αντιπροσώπευαν το 80% των εμπλουτισμένων πρωτεϊνών, αποδεικνύοντας περαιτέρω την ειδικότητα του PDPL (Συμπληρωματικό Σχήμα 8a–d).
Έχοντας διαπιστώσει την ικανότητα του PDPL να εκτελεί σήμανση εγγύτητας σε οργανίδια, στη συνέχεια δοκιμάσαμε εάν το PDPL θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση συνεργατών δέσμευσης POI.Συγκεκριμένα, επιδιώξαμε να ορίσουμε την ανάλυση PDPL των κυτοσολικών πρωτεϊνών, οι οποίες θεωρούνται πιο δύσκολοι στόχοι από τους αντίστοιχους εντοπισμένους στη μεμβράνη λόγω της εξαιρετικά δυναμικής φύσης τους.Η βρωμοτομική και η εξωτερματική πρωτεΐνη (BET) BRD4 έχει προσελκύσει την προσοχή μας για τον βασικό της ρόλο σε διάφορες ασθένειες 35, 36 .Το σύμπλοκο που σχηματίζεται από το BRD4 είναι ένας μεταγραφικός συνενεργοποιητής και ένας σημαντικός θεραπευτικός στόχος.Με τη ρύθμιση της έκφρασης των παραγόντων μεταγραφής c-myc και Wnt5a, η BRD4 θεωρείται ότι είναι βασικός καθοριστικός παράγοντας της οξείας μυελογενούς λευχαιμίας (AML), του πολλαπλού μυελώματος, του λεμφώματος Burkitt, του καρκίνου του παχέος εντέρου και των φλεγμονωδών ασθενειών37,38.Επιπλέον, ορισμένοι ιοί στοχεύουν το BRD4 για τη ρύθμιση της ιικής και κυτταρικής μεταγραφής, όπως ο ιός των θηλωμάτων, ο HIV και ο SARS-CoV-236,39.
Για να χαρτογραφήσουμε την αλληλεπίδραση BRD4 χρησιμοποιώντας PDPL, συνδυάσαμε το miniSOG με μια σύντομη N- ή C-τερματική ισομορφή του BRD4.Τα πρωτεομικά αποτελέσματα αποκάλυψαν υψηλό βαθμό επικάλυψης μεταξύ των δύο κατασκευών (Συμπληρωματικό Σχήμα 9α).Το πυρηνικό πρωτέωμα που ταυτοποιήθηκε με το miniSOG-H2B καλύπτει το 77,6% των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με το BRD4 (Συμπληρωματικό Σχήμα 9β).Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικοί χρόνοι φωτισμού (2, 5, 10, 20 λεπτά) για τη ρύθμιση της ακτίνας του δείκτη (Εικ. 4a και συμπληρωματικά δεδομένα 3).Συμπεραίνουμε ότι σε μικρότερες φωτοπεριόδους, το PDPL θα επισημαίνει κυρίως τους εταίρους άμεσης δέσμευσης, ενώ οι μεγαλύτερες περίοδοι θα περιλαμβάνουν πρωτεΐνες που προσδιορίζονται κατά τη διάρκεια μικρότερων περιόδων φωτοενεργοποίησης καθώς και έμμεσους στόχους σε σύμπλοκα σήμανσης.Στην πραγματικότητα, βρήκαμε ισχυρή επικάλυψη μεταξύ γειτονικών χρονικών σημείων (84,6% για 2 και 5 λεπτά, 87,7% για 5 και 10 λεπτά, 98,7% για 10 και 20 λεπτά) (Εικ. 4β και Συμπληρωματικό Σχήμα 9γ).Σε όλες τις πειραματικές ομάδες, βρήκαμε όχι μόνο την αυτοεπισήμανση BRD4, αλλά και αρκετούς γνωστούς στόχους όπως MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A και HMGB1 σχολιασμένους στη βάση δεδομένων συμβολοσειρών.Η ιοντική ισχύς αυτών των στόχων είναι ανάλογη του χρόνου έκθεσης (Εικ. 4γ και Συμπληρωματικό Σχ. 9δ).Η ανάλυση GO των πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν στην ομάδα των 2 λεπτών έδειξε ότι οι ταυτοποιημένες πρωτεΐνες εντοπίστηκαν στον πυρήνα και συμμετείχαν στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και στη λειτουργία της πολυμεράσης RNA.Η μοριακή λειτουργία της πρωτεΐνης εμπλουτίστηκε σε δέσμευση χρωματίνης ή μεταγραφική συνενεργοποίηση, σύμφωνα με τη λειτουργία BRD4 (Εικ. 4δ).Η ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης με ενεργοποιημένη βάση δεδομένων χορδών αποκάλυψε ένα πρώτο επίπεδο έμμεσων αλληλεπιδράσεων μεταξύ συμπλεγμάτων αλληλεπίδρασης της οικογένειας BRD4 και HDAC όπως SIN3A, NCOR2, BCOR και SAP130 (Εικ. 4e και Συμπληρωματικό Σχήμα 9e), σύμφωνα με ακετυλιωμένους ιστόνες που δεσμεύουν BRD4 και HDAC ..Επιπλέον, αντιπροσωπευτικοί στόχοι που ταυτοποιήθηκαν από το LC-MS/MS, συμπεριλαμβανομένων των Sin3A, NSUN2, Fus και SFPQ, επιβεβαιώθηκαν με στύπωμα Western (Εικ. 4f).Πρόσφατα, η βραχεία ισομορφή του BRD4 έχει αναφερθεί ότι σχηματίζει πυρήνες με ιδιότητες διαχωρισμού υγρής-υγρής φάσης (LLPS).Οι πρωτεΐνες δέσμευσης RNA Fus και SFPQ μεσολαβούν στο LLPS διαφόρων κυτταρικών διεργασιών και έχουν αναγνωριστεί εδώ ως μη καταγεγραμμένες πρωτεΐνες δέσμευσης BRD4.Η αλληλεπίδραση μεταξύ BRD4 και SFPQ επιβεβαιώθηκε με πειράματα συν-ανοσοκαθίζησης (συν-ΙΡ) (Σχήμα 4g), υποδεικνύοντας έναν άλλο μηχανισμό για τον διαχωρισμό υγρής-υγρής φάσης με τη μεσολάβηση BRD4 που αξίζει περαιτέρω έρευνα.Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το PDPL είναι μια ιδανική πλατφόρμα για τον εντοπισμό γνωστών πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με BRD4 καθώς και άγνωστων πρωτεϊνών σύνδεσης.
μια Σχηματική αναπαράσταση της σήμανσης εγγύτητας BRD4 με τη μεσολάβηση miniSOG, χρόνους έκθεσης: 2, 5, 10 και 20 λεπτά.β Αλληλεπικάλυψη πρωτεϊνών που προσδιορίζονται σε διαφορετικούς χρόνους φωτισμού.Ο εμπλουτισμός πρωτεΐνης που εντοπίστηκε στο HEK293T-miniSOG-BRD4 ήταν στατιστικά σημαντικός σε σύγκριση με το HEK293T άγριου τύπου.c Ένταση ιόντων κατά τον ποσοτικό προσδιορισμό μη επισημασμένων αντιπροσωπευτικών γνωστών πρωτεϊνών που δεσμεύουν το BRD4 κατά τη διάρκεια του καθορισμένου χρόνου έκθεσης.n = 3 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα.Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± τυπική απόκλιση.δ Γονιδιακή οντολογική ανάλυση (GO) πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν στην ομάδα των 2 λεπτών.Παρατίθενται οι δέκα πρώτοι όροι GO.Οι φυσαλίδες χρωματίζονται σύμφωνα με την κατηγορία όρου GO και το μέγεθος των φυσαλίδων είναι ανάλογο με τον αριθμό των πρωτεϊνών που βρίσκονται σε κάθε όρο.e Ανάλυση χορδών πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με το BRD4.Οι κίτρινοι κύκλοι είναι άμεση κόλλα και οι γκρι κύκλοι είναι η πρώτη στρώση έμμεσης κόλλας.Οι κόκκινες γραμμές αντιπροσωπεύουν τις πειραματικά καθορισμένες αλληλεπιδράσεις και οι μπλε γραμμές αντιπροσωπεύουν τις προβλεπόμενες αλληλεπιδράσεις.f Αντιπροσωπευτικοί στόχοι δέσμευσης BRD4 που ταυτοποιήθηκαν στο LC-MS/MS επαληθεύτηκαν με στύπωμα Western.g Τα πειράματα συν-ανοσοκαθίζησης επιβεβαιώνουν την αλληλεπίδραση μεταξύ SFPQ και BRD4.Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα παρέχονται με τη μορφή αρχείων πρωτογενών δεδομένων.
Εκτός από τον εντοπισμό μη καταχωρημένων στόχων που σχετίζονται με POI, υποθέτουμε ότι το PDPL θα είναι κατάλληλο για την αναγνώριση υποστρωμάτων για ένζυμα, τα οποία θα απαιτούσαν τον χαρακτηρισμό πρωτεϊνών έμμεσης δέσμευσης σε μεγάλα σύμπλοκα για να σχολιάσουν μη καταχωρημένα υποστρώματα.Το Parkin (που κωδικοποιείται από το PARK2) είναι μια λιγάση Ε3 και οι μεταλλάξεις στο parkin είναι γνωστό ότι προκαλούν αυτοσωματική υπολειπόμενη νεανική νόσο του Πάρκινσον (AR-JP)42.Επιπλέον, η παρκίνη έχει περιγραφεί ως απαραίτητη για τη μιτοφαγία (μιτοχονδριακή αυτοφαγία) και την αφαίρεση αντιδραστικών ειδών οξυγόνου.Ωστόσο, αν και έχουν εντοπιστεί αρκετά υποστρώματα πάρκου, ο ρόλος του πάρκου σε αυτήν την ασθένεια παραμένει ασαφής.Για να σχολιάσει τα αχαρακτήριστα υποστρώματά του, το PDPL δοκιμάστηκε προσθέτοντας miniSOG στο Ν- ή C-άκρο του πάρκου.Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον μεταφορέα πρωτονίων καρβονυλοκυανιδίου m-χλωροφαινυλυδραζόνη (CCCP) για να ενεργοποιηθεί η παρκίνη μέσω της οδού PINK1-Parkin.Σε σύγκριση με τα αποτελέσματά μας BRD4 PDPL, η σύντηξη του αμινοτελικού άκρου παρκίνης αποκάλυψε ένα μεγαλύτερο σύνολο πρωτεϊνών-στόχων, αν και κάλυπτε μεγαλύτερο τμήμα του C-άκρου (177 από 210) (Εικόνα 5a,b και Συμπληρωματικά Δεδομένα 4).το αποτέλεσμα είναι συνεπές με αναφορές ότι οι ετικέτες Ν-τερματικού μπορούν να ενεργοποιήσουν λανθασμένα το Parkin44.Παραδόξως, υπήρχαν μόνο 18 επικαλυπτόμενες πρωτεΐνες στα δεδομένα μας με δημοσιευμένα αποτελέσματα AP-MS για το Parkin43, πιθανότατα λόγω διαφορών μεταξύ κυτταρικών γραμμών και ροών εργασιών πρωτεϊνικής.Εκτός από τέσσερις γνωστές πρωτεΐνες (ARDM1, HSPA8, PSMD14 και PSMC3) που ταυτοποιήθηκαν με δύο μεθόδους (Εικ. 5γ)43.Για την περαιτέρω επικύρωση των αποτελεσμάτων του LC-MS/MS, η θεραπεία με PDPL και η επακόλουθη στύπωση Western χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων της ανάλυσης γονικών κυττάρων HEK293T και της σταθερής γραμμής Ν-τερματικής παρκίνης.Οι προηγουμένως άγνωστοι στόχοι CDK2, DUT, CTBP1 και PSMC4 δοκιμάστηκαν με ένα γνωστό συνδετικό, DNAJB1 (Εικ. 5d).
Ηφαιστειακή γραφική παράσταση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με το πάρκο σε κύτταρα HEK293T με σταθερά εκφρασμένο miniSOG συντηγμένο στο Ν- ή C-άκρο της παρκίνης (n = 3 ανεξάρτητα βιολογικά πειράματα).Το τεστ t Student δύο ουρών χρησιμοποιήθηκε σε ηφαίστεια.Το HEK293T χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Σημαντικά αλλαγμένες πρωτεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο (p < 0,05 και >2 φορές διαφορά έντασης ιόντων). Σημαντικά αλλαγμένες πρωτεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο (p < 0,05 και >2 φορές διαφορά έντασης ιόντων). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интензивности јонов). Σημαντικά τροποποιημένες πρωτεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο (p < 0,05 και >2 φορές διαφορά στην ένταση ιόντων).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в јоной силе). Σημαντικά τροποποιημένες πρωτεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο (p < 0,05 και > 2 φορές διαφορά στην ιοντική ισχύ).Οι σχετικές πρωτεΐνες σημαντικές για το HEK293T-miniSOG αλλά όχι σημαντικές για το HEK293T εμφανίζονται με πράσινο χρώμα.b Διάγραμμα Venn που δείχνει επικαλυπτόμενες πρωτεΐνες μεταξύ Ν-τερματικών και C-τερματικών κατασκευών.Οι ετικέτες Ν-τερματικού μπορούν να ενεργοποιήσουν λανθασμένα το parkin και να οδηγήσουν σε πιο αναγνωρίσιμες πρωτεΐνες.c Διάγραμμα Venn που δείχνει επικαλυπτόμενες πρωτεΐνες μεταξύ PDPL και AP-MS.Παρατίθενται γνωστοί αλληλεπιδρώντες, συμπεριλαμβανομένων 4 από 18 επικαλυπτόμενες πρωτεΐνες και 11 από 159 πρωτεΐνες που προσδιορίζονται ειδικά στο PDPL.δ Αντιπροσωπευτικοί στόχοι που ταυτοποιήθηκαν με LC-MS/MS επαληθεύτηκαν με στύπωμα Western.Τα Ssu72 και SNW1 αναγνωρίστηκαν ως μη καταχωρημένα υποστρώματα parkin.Αυτά τα πλασμίδια πρωτεΐνης με επισήμανση FLAG επιμολύνθηκαν σε HEK293T και HEK293T-Parkin-miniSOG ακολουθούμενη από επεξεργασία CCCP σε διάφορα χρονικά σημεία.Η υποβάθμιση ήταν πιο έντονη στη γραμμή υπερέκφρασης Parkin.f Χρησιμοποιώντας τον αναστολέα πρωτεασώματος MG132, επιβεβαιώθηκε ότι η διαδικασία αποικοδόμησης του Ssu72 και του SNW1 μεσολαβείται από την ουβικουϊτινοποίηση πρωτεασώματος.Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα παρέχονται με τη μορφή αρχείων πρωτογενών δεδομένων.
Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες που προσδιορίζονται από το PDPL πρέπει να περιλαμβάνουν πρωτεΐνες που δεσμεύουν το πάρκο και τα υποστρώματά τους.Για να ανιχνεύσουμε μη καταγεγραμμένα υποστρώματα πάρκου, επιλέξαμε επτά ταυτοποιημένες πρωτεΐνες (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 και SNW1) και επιμολύναμε πλασμίδια για να εκθέσουμε αυτά τα γονίδια σε φυσιολογικό HEK293T και να εκφράσουμε σταθερά τη θεραπεία miniSOG-Parkin'sCP33T, ακολουθούμενη από HEK2.Τα επίπεδα των πρωτεϊνών Ssu72 και SNW1 μειώθηκαν σημαντικά στη σταθερή γραμμή miniSOG-Parkin (Εικ. 5e).Η επεξεργασία με CCCP για 12 ώρες είχε ως αποτέλεσμα την πιο σημαντική αποικοδόμηση και των δύο υποστρωμάτων.Για να διερευνηθεί εάν η αποικοδόμηση των Ssu72 και SNW1 ρυθμίζεται από την πρωτεασωμική ουβικουϊτινοποίηση, ο αναστολέας πρωτεασώματος MG132 προστέθηκε για να αναστείλει τη δραστηριότητα πρωτεασώματος και στην πραγματικότητα βρήκαμε ότι η διαδικασία αποδόμησής τους ανεστάλη (Εικ. 5στ).Πρόσθετοι στόχοι χωρίς υπόστρωμα επιβεβαιώθηκαν ως αλληλεπιδρώντες Parkin χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (Συμπληρωματικό Σχήμα 10), το οποίο έδειξε συνεπή αποτελέσματα με LC-MS/MS.Συμπερασματικά, η ενσωμάτωση της ροής εργασίας PDPL με την επαλήθευση της επιμόλυνσης πρωτεΐνης στόχου επιτρέπει την αναγνώριση μη καταχωρημένων υποστρωμάτων λιγάσης Ε3.
Έχουμε αναπτύξει μια κοινή πλατφόρμα σήμανσης εγγύτητας που σας επιτρέπει να αναγνωρίζετε POI που αλληλεπιδρούν στο χώρο και στο χρόνο.Η πλατφόρμα βασίζεται στην πρωτεΐνη φωτοευαισθητοποιητή miniSOG, η οποία είναι μόνο περίπου 12 kDa, λιγότερο από το μισό μέγεθος του ώριμου ενζύμου APEX2 (27 kDa) και το ένα τρίτο του μεγέθους του TurboID (35 kDa).Το μικρότερο μέγεθος θα επεκτείνει σημαντικά το εύρος των εφαρμογών για τη μελέτη μικρών πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων.Απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση πρόσθετων φωτοευαισθητοποιητών, είτε είναι γενετικά κωδικοποιημένες πρωτεΐνες είτε μικρά μόρια, για να αυξηθεί η κβαντική απόδοση του απλού οξυγόνου και να επεκταθεί η ευαισθησία αυτής της προσέγγισης.Για την τρέχουσα έκδοση του miniSOG, μπορεί να επιτευχθεί υψηλή χρονική ανάλυση χρησιμοποιώντας μπλε φωτισμό για την ενεργοποίηση δεικτών εγγύτητας.Επιπλέον, ο μεγαλύτερος χρόνος έκθεσης απελευθέρωσε ένα μεγαλύτερο «σύννεφο» απλού οξυγόνου, με αποτέλεσμα την τροποποίηση των περισσότερων απομακρυσμένων υπολειμμάτων ιστιδίνης, την αυξημένη ακτίνα σήμανσης και την ικανότητα λεπτομέρειας της χωρικής ανάλυσης PDPL.Δοκιμάσαμε επίσης επτά χημικούς ανιχνευτές για να αυξήσουμε την αναλογία σήματος προς φόντο και διερευνήσαμε τον μοριακό μηχανισμό πίσω από αυτήν την προσέγγιση.Η ροή εργασίας TOP-ABPP σε συνδυασμό με την αμερόληπτη ανοιχτή αναζήτηση επιβεβαίωσε ότι τροποποιήσεις έγιναν μόνο στις ιστιδίνες και δεν παρατηρήθηκε σταθερό μικροπεριβάλλον για αυξημένες τροποποιήσεις ιστιδίνης, εκτός από μια μέτρια προτίμηση για τις ιστιδίνες στην περιοχή βρόχου.
Το PDPL έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για τον χαρακτηρισμό υποκυτταρικών πρωτεωμάτων με ειδικότητα πρωτεώματος και κάλυψη τουλάχιστον συγκρίσιμη με άλλες μεθόδους χημικής επισήμανσης εγγύτητας και ειδικών για οργανίδια.Οι δείκτες εγγύτητας έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για τον χαρακτηρισμό των επιφανειακών, λυσοσωμικών και σχετιζόμενων με το έκκριμα πρωτεωμάτων46,47.Πιστεύουμε ότι το PDPL θα είναι συμβατό με αυτά τα υποκυτταρικά οργανίδια.Επιπλέον, αμφισβητήσαμε το PDPL με τον εντοπισμό στόχων για τη δέσμευση κυτοσολικής πρωτεΐνης που είναι πιο περίπλοκοι από τις δεσμευμένες στη μεμβράνη πρωτεΐνες λόγω των δυναμικών τους ιδιοτήτων και της εμπλοκής τους σε πιο χρονικές αλληλεπιδράσεις.Το PDPL εφαρμόστηκε σε δύο πρωτεΐνες, τον μεταγραφικό συνενεργοποιητή BRD4 και τη σχετιζόμενη με την ασθένεια λιγάση E3 Parkin.Αυτές οι δύο πρωτεΐνες επιλέχθηκαν όχι μόνο για τις θεμελιώδεις βιολογικές τους λειτουργίες, αλλά και για την κλινική τους σημασία και τη θεραπευτική τους δυνατότητα.Για αυτά τα δύο POI, εντοπίστηκαν γνωστοί δεσμευτικοί συνεργάτες καθώς και μη καταχωρημένοι στόχοι.Συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη SFPQ που σχετίζεται με το διαχωρισμό φάσεων επιβεβαιώθηκε με co-IP, το οποίο μπορεί να υποδεικνύει έναν νέο μηχανισμό με τον οποίο το BRD4 (κοντή ισομορφή) ρυθμίζει το LLPS.Ταυτόχρονα, πιστεύουμε ότι η αναγνώριση των υποστρωμάτων Parkin είναι ένα σενάριο στο οποίο απαιτείται η αναγνώριση έμμεσων συγκολλητικών.Προσδιορίσαμε δύο μη αναγνωρισμένα υποστρώματα πάρκου και επιβεβαιώσαμε την αποδόμησή τους κατά μήκος της οδού ουβικουϊτινοποίησης-πρωτεασώματος.Πρόσφατα, μια στρατηγική παγίδευσης που βασίζεται σε μηχανισμούς έχει αναπτυχθεί για την ανίχνευση υποστρωμάτων υδρολάσης παγιδεύοντάς τα με ένζυμα.Αν και αυτή είναι μια πολύ ισχυρή μέθοδος, δεν είναι κατάλληλη για την ανάλυση υποστρωμάτων που εμπλέκονται στο σχηματισμό μεγάλων συμπλεγμάτων και απαιτεί το σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ του ενζύμου και του υποστρώματος.Αναμένουμε ότι το PDPL μπορεί να επεκταθεί για τη μελέτη άλλων πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων και οικογενειών ενζύμων, όπως οι οικογένειες deubiquitinase και metalloprotease.
Μια νέα μορφή miniSOG, που ονομάζεται SOPP3, έχει αναπτυχθεί με βελτιωμένη παραγωγή μονήρους οξυγόνου.Συγκρίναμε το miniSOG με το SOPP3 και βρήκαμε βελτιωμένη απόδοση σήμανσης, αν και η αναλογία σήματος προς θόρυβο παρέμεινε αμετάβλητη (Συμπληρωματικό Σχ. 11).Υποθέσαμε ότι η βελτιστοποίηση του SOPP3 (π.χ. μέσω της κατευθυνόμενης εξέλιξης) θα οδηγούσε σε πιο αποτελεσματικές πρωτεΐνες φωτοευαισθητοποιητές που απαιτούν μικρότερους χρόνους φωτός και έτσι θα επιτρέψουν τη σύλληψη πιο δυναμικών κυτταρικών διεργασιών.Σημειωτέον, η τρέχουσα έκδοση του PDPL περιορίζεται στο κυτταρικό περιβάλλον καθώς απαιτεί φωτισμό μπλε φωτός και δεν μπορεί να διεισδύσει σε βαθιά ιστούς.Αυτό το χαρακτηριστικό αποκλείει τη χρήση του σε μελέτες μοντέλων σε ζώα.Ωστόσο, ο συνδυασμός οπτογενετικής με PDPL θα μπορούσε να προσφέρει μια ευκαιρία για έρευνα σε ζώα, ειδικά στον εγκέφαλο.Επιπλέον, άλλοι μηχανικοί φωτοευαισθητοποιητές υπερύθρων αφαιρούν επίσης αυτόν τον περιορισμό.Αυτή τη στιγμή διεξάγεται έρευνα σε αυτόν τον τομέα.
Η κυτταρική σειρά HEK293T ελήφθη από την ATCC (CRL-3216).Η κυτταρική σειρά ήταν αρνητική για μόλυνση από μυκόπλασμα και καλλιεργήθηκε σε DMEM (Thermo, #C11995500BT) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Vistech, #SE100-B) και 1% πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (Hyclone, #SV30010).μεγαλωμένο μέσα.
Το 3-αμινοφαινυλένιο (δείγμα 3) και η (4-αιθυνυλφαινυλ)μεθαναμίνη (δείγμα 4) αγοράστηκαν από την Bidepharm.Η προπυλαμίνη (probe 2) αγοράστηκε από την Energy-chemicals.Το Ν-(2-Αμινοφαινυλ)πεντ-4-υναμίδιο (ανιχνευτής 1) συντέθηκε σύμφωνα με δημοσιευμένες μεθόδους.
Ο συμπληρωματικός Πίνακας 1 παραθέτει τα γενετικά κατασκευάσματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη.Οι αλληλουχίες miniSOG και KillerRed κλωνοποιήθηκαν από ένα πλασμίδιο δώρου από το P. Zou (Πανεπιστήμιο Πεκίνου).Η αλληλουχία στόχευσης της μιτοχονδριακής μήτρας προήλθε από τα 23 Ν-τερματικά αμινοξέα του COX4 και κλωνοποιήθηκε στους υποδεικνυόμενους φορείς χρησιμοποιώντας ένα συγκρότημα Gibson (Beyotime, #D7010S).Για τη στόχευση της μεμβράνης και του πυρήνα του ενδοπλασματικού δικτύου, SEC61B ανθρώπινο DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) ενισχύθηκε με PCR από μια βιβλιοθήκη cDNA κυττάρων HEK293T και H2B DNA (δωρεά D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) και κλωνοποιήθηκαν, όπως αναφέρθηκε παραπάνω.Εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά, άλλα γονίδια πρωτεΐνης που χρησιμοποιήθηκαν για επιμόλυνση και κατασκευή σταθερών κυτταρικών σειρών ενισχύθηκαν με PCR από τη βιβλιοθήκη cDNA κυττάρων HEK293T.Τα G3S (GGGS) και G4S (GGGGS) χρησιμοποιήθηκαν ως συνδετήρες μεταξύ της πρωτεΐνης δολώματος και του miniSOG.Μια ετικέτα επιτόπου V5 (GKPIPNPLLGLDST) προστέθηκε σε αυτά τα κατασκευάσματα σύντηξης.Για έκφραση σε θηλαστικά και για δημιουργία σταθερής κυτταρικής γραμμής, το μόρφωμα σύντηξης miniSOG υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα φακοϊού pLX304.Για βακτηριακή έκφραση, το miniSOG κλωνοποιήθηκε στον φορέα pET21a με επισήμανση 6xHis στο C-άκρο.
Τα κύτταρα HEK293T σπάρθηκαν σε 2,0 x 105 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν 24 ώρες αργότερα με ανασυνδυασμένα πλασμίδια φακοϊών (2,4 μg pLX304) και πλασμίδια συσκευασίας ιού (1,5 μg psPAG2 και 1,2 μg psPAG2 και 1,2 μg psPAG2 και 1,2 μg 0YoPo2) χρόνο με 0Bepo20 (Li. , #C0533), περίπου 80% σύντηξη.Μετά από ολονύκτια επιμόλυνση, το μέσο άλλαξε και επωάστηκε για άλλες 24 ώρες.Η συλλογή του ιού πραγματοποιήθηκε μετά από 24, 48 και 72 ώρες.Πριν από τη μόλυνση των κυτταρικών γραμμών-στόχων, το ιικό μέσο διηθήθηκε μέσω φίλτρου 0,8 μm (Merck, #millex-GP) και προστέθηκε πολυβρένιο (Solarbio, #H8761) σε συγκέντρωση 8 μg/ml.Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα αφέθηκαν να ανακτήσουν αλλάζοντας το μέσο.Τα κύτταρα επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) για τις τρεις πρώτες ανακαλλιέργειες ως επιλογή χαμηλότερης αυστηρότητας.Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν 20 μg/ml ως πιο αυστηρό σχήμα για τα επόμενα τρία περάσματα.
Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε θαλάμους 12 φρεατίων (Ibidi, #81201) σε πυκνότητα περίπου 20.000 κυττάρων ανά φρεάτιο.Για να βελτιωθεί η προσκόλληση των κυττάρων ΗΕΚ293Τ, προσθέστε 50 μg/ml φιμπρονεκτίνης (Corning, #356008) αραιωμένη σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS, Sangon, #B640435) στους 37°C.Οι θάλαμοι υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία για 1 ώρα και στη συνέχεια απομακρύνθηκαν με PBS.Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS, επωάστηκαν με 1 mM ανιχνευτή 3 σε φρέσκο ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) για 1 ώρα στους 37°C και στη συνέχεια επωάστηκαν με μπλε LED (460 nm ).) ακτινοβολήθηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Μετά από αυτό, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη σε PBS (Sangon, #Ε672002) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Η περίσσεια φορμαλδεΰδης απομακρύνθηκε από σταθεροποιημένα κύτταρα με πλύσιμο τρεις φορές με PBS.Τα κύτταρα στη συνέχεια διαπερατήθηκαν με 0,5% Triton X-100 (Sangon, #Α600198) σε PBS και πλύθηκαν 3 φορές με PBS.Στη συνέχεια αφαιρέστε τον θάλαμο και προσθέστε σε κάθε δείγμα 25 μl μίγματος αντίδρασης κλικ που περιέχει 50 μΜ Cy3-αζίδιο (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) και 0,5 mg/ml ασκορβικού νατρίου (Aladdin, αρ. S105024) και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Μετά από μια απότομη αντίδραση, τα κύτταρα πλύθηκαν έξι φορές με PBS που περιείχε 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 5% BSA (Abcone, #B24726) σε PBST για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.
Για την ανοσοχρώση εντοπισμού, τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα σύμφωνα με τις υποδεικνυόμενες συνθήκες: mAb ετικέτας αντι-V5 ποντικού (1:500, CST, #80076), mAb αντι-Hsp60 κουνελιού (1:1000), ABclonal, #A0564), πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-καλνεξίνης κουνελιού (1:500, Abcam, #ab22595) ή μονοκλωνικό αντίσωμα A/C αντι-λαμίνης κουνελιού (1:500, CST, #2032) στους 4 °C όλη τη νύχτα.Μετά από πλύση 3 φορές με PBST, τα κύτταρα επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα: κατσικίσιο αντι-κουνελιού Alexa Fluor 488 (Thermo, #Α11034) αραιωμένο 1:1000, κατσικίσιο κατά ποντικού Alexa Fluor 594 (CST, #8889) αραιωμένο 1:10.αραίωση Αραιώστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά.Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές με PBST και αντιχρωματίστηκαν με DAPI (Thermo, #D1306) σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Μετά από 3 πλύσεις με PBS, τα κύτταρα σφραγίστηκαν σε 50% γλυκερίνη (Sangon, #Α600232) σε PBS για απεικόνιση.Ελήφθησαν εικόνες ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο ZEISS LSM 900 Airyscan2 και λογισμικό ZNE 3.5.
Για απλή απεικόνιση φθορισμού οξυγόνου, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα Hanks HEPES πριν από την προσθήκη 100 ηΜ Si-DMA σε ρυθμιστικό διάλυμα Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Μετά από έκθεση στο φως, τα κύτταρα επωάστηκαν σε επωαστήρα CO2 στους 37°C για 45 λεπτά.Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα HEPES Hanks και αντιχρωματίστηκαν με Hoechst σε ρυθμιστικό διάλυμα HEPES Hanks για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο ZEISS LSM 900., #M36008) σε ρυθμιστικό διάλυμα HBSS που περιέχει ασβέστιο και μαγνήσιο.Μετά από έκθεση σε φως ή δοξορουβικίνη (MCE, #HY-15142A), τα κύτταρα επωάστηκαν σε επωαστήρα CO2 στους 37° C. για 10 λεπτά, πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα HBSS και επωάστηκαν με Hoechst σε ρυθμιστικό διάλυμα HBSS σε θερμοκρασία δωματίου.λεπτά.Η δοξορουβικίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας ανιχνευτή όπου τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μM δοξορουβικίνης σε HBSS που περιείχε 1% BSA για 30 λεπτά.Ελήφθησαν εικόνες ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο Zeiss LSM 900.
Κύτταρα ΗΕΚ293Τ που εκφράζουν σταθερά mito-miniSOG σπάρθηκαν σε πυκνότητα περίπου 30% σε τρυβλία 15 cm.Μετά από 48 ώρες, όταν επιτεύχθηκε συρροή ~80%, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS, επωάστηκαν με 1 mM Probe 3 σε φρέσκο ρυθμιστικό διάλυμα HBSS για 1 ώρα στους 37°C και στη συνέχεια φωτίστηκαν με μπλε LED για 10 λεπτά στο δωμάτιο θερμοκρασία..Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, ξύστηκαν και επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό PBS που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης χωρίς EDTA (MCE, #HY-K0011).Τα κύτταρα λύθηκαν με κατεργασία με υπερήχους στο άκρο για 1 λεπτό (1 δευτερόλεπτο και 1 δευτερόλεπτο μακριά σε πλάτος 35%).Το προκύπτον μίγμα φυγοκεντρήθηκε στα 15.871 xg για 10 λεπτά στους 4°C για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα, και η συγκέντρωση του υπερκειμένου ρυθμίστηκε στα 4 mg/mL χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Beyotime, #Ρ0009).Συνδυάστε 1 ml του παραπάνω λύματος με 0,1 mM φωτοαποικοδομήσιμο αζίδιο της βιοτίνης (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA πρόσδεμα (Aladdin, #T162437) και 1 mM SO4 incub περιστροφή για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου.Μετά από μια απότομη αντίδραση, προσθέστε το μείγμα στο προαναμεμιγμένο διάλυμα (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) σε γυάλινο φιαλίδιο των 10 ml.Τα δείγματα αναμίχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 4500 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Το κάτω και το ανώτερο διάλυμα απορρίφθηκαν, το ίζημα πλύθηκε δύο φορές με 1 ml μεθανόλης και φυγοκεντρήθηκε στα 15871 χ g για 5 λεπτά στους 4°C.Προσθέστε 1 ml ουρίας 8 Μ (Aladdin, αρ. U111902) σε 25 mM διττανθρακικό αμμώνιο (ABC, Aladdin, αρ. Α110539) για να διαλυθεί το ίζημα.Τα δείγματα ανασυστάθηκαν με 10 mM διθειοθρεϊτόλη (Sangon, #Α100281 σε 25 mM ABC) για 40 λεπτά στους 55°C ακολουθούμενα από την προσθήκη 15 mM φρέσκου ιωδοακεταμιδίου (Sangon, #Α600539) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι.Αλκυλίωση εντός 30 λεπτών..Προστέθηκαν επιπλέον 5 mM διθειοθρεϊτόλη για να σταματήσει η αντίδραση.Προετοιμάστε περίπου 100 μl σφαιριδίων αγαρόζης NeutrAvidin (Thermo, #29202) για κάθε δείγμα με πλύσιμο 3 φορές με 1 ml PBS.Το παραπάνω διάλυμα πρωτεώματος αραιώθηκε με 5 ml PBS και επωάστηκε με προπλυμένα σφαιρίδια αγαρόζης NeutrAvidin για 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου.Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές με 5 ml PBS που περιείχε 0,2% SDS (Sangon, #Α600485), 3 φορές με 5 ml PBS που περιείχε 1Μ ουρία και 3 φορές με 5 ml ddH2O.Τα σφαιρίδια στη συνέχεια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν σε 200 μl 25 mM ABC που περιείχε 1 Μ ουρία, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) και 20 ng/μl θρυψίνης (Promega, #V5280).Τρυψινοποιήστε όλη τη νύχτα στους 37°C με περιστροφή.Η αντίδραση διακόπηκε με προσθήκη μυρμηκικού οξέος (Thermo, # Α117-50) μέχρις ότου το ρΗ έφτασε στο 2-3.Τα σφαιρίδια πλύθηκαν 3 φορές με 1 ml PBS που περιείχε 0,2% SDS, 3 φορές με 1 ml PBS που περιείχε 1 Μ ουρία και στη συνέχεια 3 φορές με 1 ml απεσταγμένου νερού.Τα τροποποιημένα πεπτίδια απελευθερώθηκαν με λύση φωτός (365 nm) για 90 λεπτά χρησιμοποιώντας 200 μl MeOH 70%.Μετά τη φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο συλλέχθηκε.Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά με 100 μl MeOH 70% και τα υπερκείμενα συνενώθηκαν.Τα δείγματα ξηράνθηκαν σε συμπυκνωτή κενού Speedvac και αποθηκεύτηκαν στους -20°C μέχρι την ανάλυση.
Για τον προσδιορισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό των απλών πεπτιδίων τροποποιημένων με οξυγόνο, τα δείγματα επαναδιαλύθηκαν σε μυρμηκικό οξύ 0,1% και 1 μg πεπτιδίων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας φασματόμετρο μάζας Orbitrap Fusion Lumos Tribrid εξοπλισμένο με πηγή νανο ESI από την Tune και Xcalibur από το λογισμικό πωλητή 4.3.Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε μια εσωτερικά γεμισμένη τριχοειδή στήλη 75 μm x 15 cm με υλικό C18 3 μm (ReproSil-pur, #r13.b9.) και συνδέθηκαν σε ένα σύστημα EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν με γραμμική χρωματογραφία βαθμίδωσης 95 λεπτών από 8% διαλύτη Β σε 50% διαλύτη Β (Α = 0,1% μυρμηκικό οξύ σε νερό, Β = 0,1% μυρμηκικό οξύ σε 80% ακετονιτρίλιο), στη συνέχεια αυξήθηκαν γραμμικά σε 98% Β λεπτό σε 6 λεπτά με ταχύτητα ροής 300 nl/min.Το Orbitrap Fusion Lumos συλλέγει δεδομένα εναλλάξ μεταξύ πλήρους σάρωσης MS και σάρωσης MS2 ανάλογα με τα δεδομένα.Η τάση εκτόξευσης ρυθμίστηκε στα 2,1 kV και η θερμοκρασία του τριχοειδούς μεταφοράς ιόντων ήταν 320°C.Συλλέχθηκαν φάσματα MS (350-2000 m/z) με ανάλυση 120.000, AGC 4 × 105 και μέγιστο χρόνο εισόδου 150 ms.Οι 10 πιο συνηθισμένοι πολλαπλά φορτισμένοι πρόδρομοι σε κάθε πλήρη σάρωση κατακερματίστηκαν χρησιμοποιώντας HCD με κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης 30%, παράθυρο απομόνωσης τετραπόλων 1,6 m/z και ρύθμιση ανάλυσης 30.000.Ένας στόχος AGC για διαδοχική φασματομετρία μάζας χρησιμοποιώντας 5×104 και μέγιστο χρόνο εισόδου 150 ms.Η δυναμική εξαίρεση έχει οριστεί στα 30 δευτερόλεπτα. Τα μη εκχωρημένα ιόντα ή αυτά με φορτίο 1+ και >7+ απορρίφθηκαν για MS/MS. Τα μη εκχωρημένα ιόντα ή αυτά με φορτίο 1+ και >7+ απορρίφθηκαν για MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Τα μη εκχωρημένα ιόντα ή ιόντα με φορτίο 1+ και >7+ απορρίφθηκαν για MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Μη καθορισμένα ιόντα ή ιόντα με φορτία 1+ και >7+ απορρίφθηκαν για MS/MS.
Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα υποβάλλονται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας την υπολογιστική πλατφόρμα FragPipe που βασίζεται στο MSFragger.Οι προκαταλήψεις μάζας και τα αντίστοιχα αμινοξέα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο ανοιχτής αναζήτησης με ανοχή μάζας πρόδρομου από -150 έως 500 Da.Τα τροποποιημένα πεπτίδια στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τροποποιήσεις ιστιδίνης με κέρδη μάζας +229,0964 και +247,1069 Da σε PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Κύτταρα που εκφράζουν σταθερά το συντηγμένο γονίδιο miniSOG επιστρώθηκαν σε δίσκους 6 cm.Όταν έφτασαν στο ~80% συρροή, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με HBSS (Gibco, #14025092), στη συνέχεια επωάστηκαν με χημικούς ανιχνευτές σε HBSS για 1 ώρα στους 37°C και φωτίστηκαν με μπλε φως.LED 10W για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Για να προσδιοριστεί ποιος τύπος αντιδραστικών ειδών οξυγόνου εμπλέκεται στην PDPL, 0,5 mM βιταμίνης C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) 100 mM μαννιτόλης (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 προστέθηκαν στα κύτταρα ως συμπληρώματα.Μετά από πλύση με κρύο PBS, τα κύτταρα αποξέστηκαν, συλλέχθηκαν σε φυγοκεντρικούς σωλήνες 1,5 ml και υποβλήθηκαν σε υπερήχους με άκρο για 1 λεπτό σε 200 μl PBS με 1x αναστολέα πρωτεάσης χωρίς EDTA (1 s και 1 s χωρίς, πλάτος 35%).Το προκύπτον μίγμα φυγοκεντρήθηκε στα 15.871 χ g για 10 λεπτά στους 4 °C και η συγκέντρωση του υπερκειμένου ρυθμίστηκε στο 1 mg/mL χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA.Περίπου 50 μΙ του παραπάνω λύματος επωάστηκαν με 0,1 mM αζίδιο ροδαμίνης (Aladdin, αρ. Τ131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA πρόσδεμα και 1 mM CuS04 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με περιστροφή από κάτω προς τα πάνω.Μετά την αντίδραση κρότου, η καθίζηση με ακετόνη πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη 250 μl προψυγμένης ακετόνης στα δείγματα, επώαση στους -20°C για 20 λεπτά και φυγοκέντρηση στα 6010 × g για 10 λεπτά στους 4°C.Συλλέξτε το σφαιρίδιο και βράστε σε 50 µl 1x ρυθμιστικού διαλύματος Laemmli για 10 λεπτά στους 95 °C.Στη συνέχεια, τα δείγματα αναλύθηκαν σε πηκτώματα μήκους SDS-PAGE και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης Bio-rad ChemiDoc MP Touch με το λογισμικό Image Lab Touch.
Η έκφραση και ο καθαρισμός της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης miniSOG-6xHis πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως.Εν συντομία, κύτταρα Ε. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) μετασχηματίστηκαν με pET21a-miniSOG-6xHis και η έκφραση πρωτεΐνης προκλήθηκε με 0,5 mM IPTG (Sangon, #Α600168).Μετά την κυτταρική λύση, οι πρωτεΐνες καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αγαρόζης Ni-NTA (MCE, αρ. 70666), υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι PBS και αποθηκεύτηκαν στους -80°C.
Για έναν in vitro προσδιορισμό εγγύτητας με ετικέτα, αναμείξτε 100 μM καθαρισμένου miniSOG, 1 mM ανιχνευτή 3 και 1 μg αντι-επισήμανσης μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (TransGen, #HT501-01) σε PBS σε συνολικό όγκο αντίδρασης 50 μl..Το μίγμα της αντίδρασης ακτινοβολήθηκε με μπλε φως LED για 0, 2, 5, 10 και 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Το μίγμα επωάστηκε με 0,1 mM βιοτίνης-PEG3-αζίδιο (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA πρόσδεμα, και 1 mM CuS04 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε αναδευτήρα κίνησης προς τα πάνω.Μετά από μια απότομη αντίδραση, προσθέστε 4x ρυθμιστικό διάλυμα Laemmli's απευθείας στο μείγμα και βράστε στους 95°C για 10 λεπτά.Τα δείγματα αναλύθηκαν σε πηκτώματα SDS-PAGE και αναλύθηκαν με στύπωμα western με στρεπταβιδίνη-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Ένα συνθετικό πεπτίδιο που περιέχει ιστιδίνη με C-τερματική αμίδωση (LHDALDAK-CONH2) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της κοντινής επισήμανσης με βάση το πεπτίδιο in vitro.Σε αυτήν τη δοκιμασία, 100 μΜ καθαρισμένο miniSOG, 10 mM ανιχνευτής 3 και 2 μg/ml συνθετικό πεπτίδιο αναμίχθηκαν σε PBS σε συνολικό όγκο αντίδρασης 50 μl.Το μίγμα της αντίδρασης ακτινοβολήθηκε με μπλε φως LED για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου.Ένα μικρολίτρο δείγματος αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight φασματόμετρο μάζας με λογισμικό ανάλυσης φάσματος MassLynx).
Κύτταρα HEK293T που εκφράζουν σταθερά το γονίδιο σύντηξης miniSOG σπάρθηκαν σε δίσκους 10 cm για γραμμές με διαφορετικό εντοπισμό οργανιδίων (Mito, ER, Nucleus) και δίσκους 15 cm για γραμμές Parkin-miniSOG και BRD4-miniSOG.Μετά την επίτευξη της συρροής ~ 90%, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με HBSS, στη συνέχεια επωάστηκαν με ανιχνευτή 3 σε HBSS για 1 ώρα στους 37°C και φωτίστηκαν με μπλε LED 10 W σε θερμοκρασία δωματίου.Για σήμανση χωρίς επαφή του Parkin, προστέθηκε 10 μΜ φορέας πρωτονίου καρβονυλοκυανιδίου m-χλωροφαινυλυδραζόνη CCCP (Solarbio, #C6700) με ανιχνευτή 3 σε HBSS για 1 ώρα στους 37°C.Τα στάδια λύσης κυττάρου, χημεία κλικ, αναγωγής και αλκυλίωσης ήταν τα ίδια με αυτά που περιγράφηκαν παραπάνω, με τη διαφορά ότι προστέθηκαν 2 mg προϊόντος λύσης και χρησιμοποιήθηκε αζίδιο βιοτίνης PEG3 στην αντίδραση κλικ αντί για φωτοδιασπώμενο αζίδιο βιοτίνης.Μετά τον εμπλουτισμό, τα σφαιρίδια πλύθηκαν 3 φορές με 5 ml PBS που περιέχει 0,2% SDS, 3 φορές με 5 ml PBS που περιέχει 1 Μ ουρία και 3 φορές με 5 ml PBS.Στη συνέχεια, 2 μg τρυψίνης προστέθηκαν σε 300 μΙ 25 mM ABC που περιείχε 1 Μ ουρία για να διασπαστεί η πρωτεΐνη όλη τη νύχτα στους 37°C.Η αντίδραση σταμάτησε με προσθήκη μυρμηκικού οξέος μέχρις ότου επιτευχθεί ένα ρΗ 2-3.Μετά από θρυψινοποίηση σε σφαιρίδια, το διάλυμα πεπτιδίου αφαλατώθηκε χρησιμοποιώντας στήλη SOLA μ HRP (Thermo, #60209-001) και ξηράνθηκε σε συμπυκνωτή κενού Speedvac.Τα πεπτίδια επαναδιαλύθηκαν σε μυρμηκικό οξύ 0,1% και 500 ng πεπτιδίων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας φασματόμετρο μάζας Orbitrap Fusion Lumos Tribrid εξοπλισμένο με την πηγή νανο-ESI που περιγράφηκε παραπάνω.Τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν σε εμπορικές προστήλες RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, αρ. 164946) και αναλυτικές στήλες RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, αρ. 164941), και οι δύο γεμάτες με 2 μm.κλίση από 8% σε 35% ACN σε 60 λεπτά, στη συνέχεια αυξήθηκε γραμμικά στο 98% B σε 6 λεπτά με ρυθμό ροής 300 Nl/min.Συλλέχθηκαν φάσματα MS (350-1500 m/z) με ανάλυση 60.000, AGC 4 × 105 και μέγιστο χρόνο εισόδου 50 ms.Τα επιλεγμένα ιόντα κατακερματίστηκαν διαδοχικά με HCD σε κύκλους 3 δευτερολέπτων με κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης 30%, παράθυρο απομόνωσης τετραπόλων 1,6 m/z και ανάλυση 15000. Ένας στόχος AGC φασματόμετρο μάζας 5 × 104 σε σειρά και μέγιστος χρόνος έγχυσης χρησιμοποιήθηκαν 22 ms.Η δυναμική εξαίρεση έχει οριστεί στα 45 δευτερόλεπτα. Τα μη εκχωρημένα ιόντα ή αυτά με φορτίο 1+ και >7+ απορρίφθηκαν για MS/MS. Τα μη εκχωρημένα ιόντα ή αυτά με φορτίο 1+ και >7+ απορρίφθηκαν για MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Τα μη εκχωρημένα ιόντα ή ιόντα με φορτίο 1+ και >7+ απορρίφθηκαν για MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Μη καθορισμένα ιόντα ή ιόντα με φορτία 1+ και >7+ απορρίφθηκαν για MS/MS.
Τα βήματα προετοιμασίας του δείγματος μέχρι τον εμπλουτισμό των σφαιριδίων NeutrAvidin ήταν τα ίδια όπως στην ανάλυση LC-MS/MS που περιγράφηκε παραπάνω.Περίπου 50 μg λύματος χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος για τον έλεγχο φόρτωσης και 2 mg λύματος χρησιμοποιήθηκαν για αντιδράσεις κλικ.Μετά από εμπλουτισμό και πλύση με νετραβιδίνη, οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν προσθέτοντας 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος Laemmli στα σφαιρίδια ρητίνης αγαρόζης και βράζοντας στους 95°C για 5 λεπτά.Δείγματα εισόδου φορτίου ελέγχου και εμπλουτισμένα με σφαιρίδια αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Milipore, #ISEQ00010) με τυπικές μεθόδους στυπώματος Western.Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα (Sangon, #Α600669) σε TBS που περιείχε 0,1% tween-20 (TBST) και επωάστηκαν διαδοχικά με πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα.Τα πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν 1:1000 σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBST και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C.Δευτερεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αναλογία 1:5000 και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου.Οι μεμβράνες οπτικοποιήθηκαν με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης Chemidoc MP.Όλες οι μη κομμένες σαρώσεις κηλίδων και πηκτωμάτων στο σχήμα παρουσιάζονται ως ακατέργαστα δεδομένα.
Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη περιελάμβαναν μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού anti-SFPQ (CST, αρ. 71992), μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-FUS (CST, αρ. 67840), πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-NSUN2 κουνελιού (Proteintech, αρ. 20854-1- AP), πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού anti-mSin3A (Abcam, #ab3479), μονοκλωνικό αντίσωμα κατά ποντικού (TransGen, #HT201-02), μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά β-ακτίνης (TransGen, #HC201-01), αντι-κουνέλι -CDK2 μονοκλωνικό αντίσωμα (ABclonal, #A0094), μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού στο CTBP1 (ABclonal, #A11600), πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού στο DUT (ABclonal, #A2901), πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού στο PSMC4 (ABclonal, #A2505), DNAJB1 πολυκλωνικό αντίσωμα (ABclonal, # Α5504).Αυτά τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1000 σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBST.Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη περιελάμβαναν IgG κατά κουνελιού (TransGen, #HS101-01), IgG κατά ποντικού (TransGen, #HS201-01) σε αραίωση 1:5000.
Για να διερευνηθεί περαιτέρω εάν το BRD4 αλληλεπιδρά με το SFPQ, σταθερά κύτταρα HEK293T και BRD4-miniSOG που υπερεκφράζουν το HEK293T επιστρώθηκαν σε δίσκους 10 cm.Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και λύθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) με αναστολέα πρωτεάσης χωρίς EDTA για 30 λεπτά στους 4°C.Μετά από αυτό, τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν σε σωλήνες φυγοκέντρησης 1,5 ml και φυγοκεντρήθηκαν στα 15.871 xg για 10 λεπτά στους 4°C.Το υπερκείμενο συλλέχτηκε και επωάστηκε με 5 μg επισημασμένου αντι-V5 μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (CST, #80076) όλη τη νύχτα στους 4°C.Πλύνετε περίπου 50 μl μαγνητικών σφαιριδίων πρωτεΐνης A/G (MCE, #HY-K0202) δύο φορές με PBS που περιέχει 0,5% Tween-20.Στη συνέχεια τα κυτταρολύματα επωάστηκαν με μαγνητικά σφαιρίδια για 4 ώρες στους 4°C με περιστροφή από κάτω προς τα πάνω.Στη συνέχεια τα σφαιρίδια πλύθηκαν τέσσερις φορές με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος PBST και βράστηκαν στους 95°C για 5 λεπτά.Τα δείγματα αναλύθηκαν σε πηκτώματα SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF χρησιμοποιώντας τυπικές μεθόδους στυπώματος Western.Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBST και επωάστηκαν διαδοχικά με πρωτογενή και δευτερεύοντα αντισώματα.Πρωτεύον αντίσωμα Rabbit anti-SFPQ μονοκλωνικό αντίσωμα (CST, #71992) χρησιμοποιήθηκε σε αναλογία 1:1000 σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBST και επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 4°C.Αντι-κουνελιού IgG χρησιμοποιήθηκε σε αναλογία 1:5000 και επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου.Οι μεμβράνες οπτικοποιήθηκαν με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης Chemidoc MP.
Όλες οι δομές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση Solvent Accessible Surface Area (SASA) ελήφθησαν από την Protein Data Bank (PDB)52 ή τη βάση δεδομένων AlphaFold Protein Structure53.Το απόλυτο SASA υπολογίστηκε για κάθε υπόλειμμα χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα FreeSASA.Χρησιμοποιήθηκαν μόνο πλήρη και ξεκάθαρα δεδομένα SASA για την επισημασμένη ιστιδίνη και τα γειτονικά της για να ληφθεί ο μέσος όρος SASA για κάθε δομή.Η σχετική προσβασιμότητα σε διαλύτη (RSA) για κάθε ιστιδίνη υπολογίστηκε διαιρώντας την απόλυτη τιμή SASA με την εμπειρική μέγιστη δυνατή επιφάνεια υπολειμμάτων που είναι διαθέσιμη στον διαλύτη.Όλες οι ιστιδίνες ταξινομήθηκαν στη συνέχεια ως κρυφές εάν η μέση RSA ήταν κάτω από 20%, διαφορετικά εκτέθηκαν56.
Τα ακατέργαστα αρχεία που ελήφθησαν σε λειτουργία DDA αναζητήθηκαν χρησιμοποιώντας το Proteome Discoverer (v2.5) ή το MSfragger (Fragpipe v15.0) στην κατάλληλη βάση δεδομένων επαληθευμένων πρωτεϊνών SwissProt που περιέχει κοινές προσμίξεις.Τα πεπτίδια απαιτούσαν πλήρη θρυψίνη με δύο ελλείπουσες θέσεις διάσπασης, μεθυλίωση καρβαμοϋλίου ως σταθερή τροποποίηση και οξείδωση μεθειονίνης ως δυναμική τροποποίηση.Οι ανοχές βάρους προδρόμου και θραύσματος ορίστηκαν σε 10 ppm και 0,02 Da (MS2 Orbitrap), αντίστοιχα. Τα χτυπήματα ρύπανσης αφαιρέθηκαν και οι πρωτεΐνες φιλτραρίστηκαν για να ληφθεί ένα ψευδές ποσοστό ανακάλυψης <1%. Τα χτυπήματα ρύπανσης αφαιρέθηκαν και οι πρωτεΐνες φιλτραρίστηκαν για να ληφθεί ένα ψευδές ποσοστό ανακάλυψης <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Τα χτυπήματα ρύπων αφαιρέθηκαν και οι πρωτεΐνες φιλτραρίστηκαν για να δώσουν ένα ποσοστό ψευδούς ανίχνευσης <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. Τα χτυπήματα ρύπων αφαιρέθηκαν και οι πρωτεΐνες φιλτραρίστηκαν για να επιτευχθεί ψευδώς θετικό ποσοστό <1%.Για ποσοτική ανάλυση χωρίς τη χρήση ετικετών, χρησιμοποιήθηκε κανονικοποιημένη περιεκτικότητα πρωτεΐνης από τρεις βιολογικές επαναλήψεις.Η ανάλυση υποκυτταρικού εντοπισμού πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Gene Ontology (GO) από την DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 και βάσεις δεδομένων που συντάχθηκαν και δημοσιεύθηκαν από την ομάδα Alice Ting.Ο χάρτης του ηφαιστείου ελήφθη από τον Περσέα (v1.6.15.0). Οι αλλαγές στο πολλαπλάσιο της αφθονίας των πρωτεϊνών δοκιμάστηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας ένα τεστ t διπλής όψης και τα χτυπήματα πρωτεΐνης ταυτοποιήθηκαν με αλλαγή αφθονίας >2 (εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά) και τιμή p <0,05. Οι αλλαγές στο πολλαπλάσιο της αφθονίας των πρωτεϊνών δοκιμάστηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας ένα τεστ t διπλής όψης και τα χτυπήματα πρωτεΐνης ταυτοποιήθηκαν με αλλαγή αφθονίας >2 (εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά) και τιμή p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость со использованием двустороннего t-criteriя, и совпадения белков были идентифицированы изменением содержания> 2 (если не 5, значение) Οι αλλαγές στο πτυχίο της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη δοκιμάστηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας ένα τεστ t δύο ουρών και ταυτοποιήθηκαν οι πρωτεϊνικές αντιστοιχίες με αλλαγή περιεχομένου >2 (εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά) και τιμή ap <0,05.使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质命中的丰度变化> 2（除非另有说明）和p 值<0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли со использованием двустороннего t-criteriя, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иноей <0, и p.-. Η στατιστική σημασία των πολλαπλών αλλαγών στην περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας ένα τεστ t δύο ουρών και προσδιορίστηκαν οι πρωτεϊνικές αντιστοιχίες για αλλαγές περιεχομένου >2 (εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά) και τιμές p <0,05.Η ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση GO μαζί με τη βάση δεδομένων String.
Πραγματοποιήθηκαν τρία βιολογικά αντίγραφα με παρόμοια αποτελέσματα.Η στατιστική ανάλυση έγινε με GraphPad Prism (λογισμικό GraphPad) και δημιουργήθηκαν γραφήματα ηφαιστείων με Perseus (v1.6.15.0).Για να συγκριθούν οι δύο ομάδες, οι τιμές p προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα τεστ t Student δύο ουρών.Μόνο οι πρωτεΐνες μονήρους που ταυτοποιήθηκαν τουλάχιστον δύο φορές στην πειραματική ομάδα συμπεριλήφθηκαν στα ηφαίστεια και οι αντίστοιχες τιμές που λείπουν στην ομάδα ελέγχου αντικαταστάθηκαν με Perseus από κανονική κατανομή, έτσι ώστε να μπορεί να υπολογιστεί η τιμή p.Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση.Σε πρωτεομικές αναλύσεις για στατιστική ανάλυση, διατηρήθηκε η αφθονία των πρωτεϊνών που εμφανίστηκαν σε τουλάχιστον δύο βιολογικά αντίγραφα.Δεν χρησιμοποιήθηκαν στατιστικές μέθοδοι για τον προκαθορισμό του μεγέθους του δείγματος.Τα πειράματα δεν είναι τυχαία.Οι ερευνητές δεν ήταν τυφλοί στα καθήκοντα κατά τη διάρκεια του πειράματος και της αξιολόγησης των αποτελεσμάτων.
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το σχεδιασμό της μελέτης, ανατρέξτε στην περίληψη της Έκθεσης Έρευνας Φύσης που συνδέεται με αυτό το άρθρο.
Τα δεδομένα φασματομετρίας μάζας που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη υποβλήθηκαν στην κοινοπραξία ProteomeXchange μέσω του αποθετηρίου συνεργατών iProX57 με το αναγνωριστικό δεδομένων PXD034811 (δεδομένο σύνολο δεδομένων PDPL-MS).Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα παρέχονται με τη μορφή αρχείων πρωτογενών δεδομένων.Αυτό το άρθρο παρέχει τα αρχικά δεδομένα.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Γνωρίζοντας τη γειτονιά: χρήση βιοτινυλίωσης που εξαρτάται από την εγγύτητα για τον χαρακτηρισμό πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων και χαρτογράφηση οργανιδίων. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Γνωρίζοντας τη γειτονιά: χρήση βιοτινυλίωσης που εξαρτάται από την εγγύτητα για τον χαρακτηρισμό πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων και χαρτογράφηση οργανιδίων.Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. Εξοικείωση με το περιβάλλον: χρήση βιοτινυλίωσης που εξαρτάται από την εγγύτητα για τον χαρακτηρισμό πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων και χαρτογράφηση οργανιδίων. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物徶并 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Κατανοώντας τη γειτονιά: χρησιμοποιήστε την εξάρτηση της γειτονιάς από τη βιολογική ζωή.Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. Κατανόηση της εγγύτητας: χαρακτηρισμός συμπλεγμάτων πρωτεϊνών και χαρτογράφηση οργανιδίων χρησιμοποιώντας βιοτινυλίωση που εξαρτάται από την εγγύτητα.Ρεύμα.Η γνώμη μου.Χημική ουσία.biology 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et αϊ.Χαρτογράφηση του μικροπεριβάλλοντος με μεταφορά ενέργειας Dexter στα κύτταρα του ανοσοποιητικού.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Δίκτυα κλίμακας δύο πρωτεοειδών ανιχνεύουν ειδική για κύτταρο αναδιαμόρφωση της ανθρώπινης αλληλεπίδρασης.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Ώρα δημοσίευσης: Σεπ-15-2022
