Νέα

Οι παραδοσιακές διαγνωστικές στρατηγικές για την ανίχνευση μολυσματικών ασθενειών απαιτούν τη χρήση οργάνων πάγκου που δεν είναι κατάλληλα για δοκιμές στο σημείο της φροντίδας (POCT).Το Emerging microfluidics είναι μια εξαιρετικά μικροσκοπική, αυτοματοποιημένη και ολοκληρωμένη τεχνολογία που αποτελεί πιθανή εναλλακτική λύση στις παραδοσιακές μεθόδους για γρήγορη, χαμηλού κόστους, ακριβή επιτόπια διάγνωση.Οι μοριακές διαγνωστικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται ευρέως σε μικρορευστικές συσκευές ως οι πιο αποτελεσματικές μέθοδοι για την ανίχνευση παθογόνων.Αυτή η ανασκόπηση συνοψίζει τις πρόσφατες εξελίξεις στη μοριακή διάγνωση μολυσματικών ασθενειών με βάση τα μικρορευστά, τόσο από ακαδημαϊκή όσο και από βιομηχανική άποψη.Αρχικά, περιγράφουμε μια τυπική επεξεργασία νουκλεϊκών οξέων στο τσιπ, συμπεριλαμβανομένης της προεπεξεργασίας δείγματος, της ενίσχυσης και της ανάγνωσης σήματος.Στη συνέχεια συγκρίνονται τα χαρακτηριστικά, τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα των τεσσάρων τύπων πλατφορμών μικρορευστών.Στη συνέχεια, θα συζητήσουμε τη χρήση ψηφιακών αναλύσεων για τον απόλυτο ποσοτικό προσδιορισμό των νουκλεϊκών οξέων.Τόσο οι κλασικές όσο και οι πρόσφατες εμπορικές συσκευές μοριακής διάγνωσης που βασίζονται σε μικρορευστά συνοψίζονται ως απόδειξη της τρέχουσας κατάστασης της αγοράς.Τέλος, προτείνουμε μελλοντικές κατευθύνσεις για τη μικρορευστολογική διάγνωση των λοιμωδών νοσημάτων.
Οι μολυσματικές ασθένειες προκαλούνται από παθογόνους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των βακτηρίων, των ιών και των παρασίτων, που διανέμονται σε όλο τον κόσμο.Σε αντίθεση με άλλες ασθένειες, τα παθογόνα μολύνονται γρήγορα και εξαπλώνονται μεταξύ των ανθρώπων και των ζώων ξενιστών μέσω του εμβολιασμού, του αέρα και του νερού [1].Η πρόληψη των μολυσματικών ασθενειών είναι ζωτικής σημασίας ως μέτρο δημόσιας υγείας.Τρεις κύριες στρατηγικές για την καταπολέμηση των μολυσματικών ασθενειών: (1) έλεγχος της πηγής μόλυνσης.(2) διακοπή της διαδρομής μετάδοσης.(3) προστασία των ευπαθών πληθυσμών.Μεταξύ των κύριων στρατηγικών, ο έλεγχος της πηγής μόλυνσης θεωρείται η πιο σημαντική στρατηγική λόγω της ευκολίας και του χαμηλού κόστους του.Η ταχεία διάγνωση, η απομόνωση και η θεραπεία των μολυσμένων ατόμων είναι κρίσιμες και απαιτούν γρήγορες, ευαίσθητες και ακριβείς διαγνωστικές στρατηγικές [2].Η τρέχουσα διάγνωση μολυσματικών ασθενειών συνήθως συνδυάζει κλινική εξέταση με βάση σημεία και συμπτώματα και εργαστηριακές μελέτες όπως κυτταροκαλλιέργεια και μοριακή διάγνωση, που απαιτούν εκπαιδευμένο προσωπικό, διαδικασίες έντασης εργασίας και ακριβό εξοπλισμό δοκιμών [3, 4].Η πρόληψη εστιών μολυσματικών ασθενειών απαιτεί ταχεία, φθηνή και ακριβή τοπική διάγνωση, ειδικά σε περιοχές με περιορισμένους πόρους όπου οι μολυσματικές ασθένειες είναι συχνές και σοβαρές [5], καθώς και θεραπεία στην έρημο ή στο πεδίο της μάχης, όπου οι καταστάσεις έκτακτης ανάγκης είναι απρόβλεπτες..η ιατρική περίθαλψη είναι περιορισμένη [6].Σε αυτό το πλαίσιο, η μικρορευστοποίηση είναι μια τεχνολογία που συνδυάζει τεχνολογίες μικροηλεκτρομηχανικών συστημάτων, νανοτεχνολογία ή επιστήμη υλικών για ακριβή χειρισμό υγρών [7,8,9,10], παρέχοντας νέες δυνατότητες για ανίχνευση σημείου φροντίδας (POCT).) μολυσματικοί παράγοντες εκτός νοσοκομείων και εργαστηρίων.Σε σύγκριση με τα παραδοσιακά χρονοβόρα διαγνωστικά, η τεχνολογία microfluidic προσφέρει εξοικονόμηση δειγμάτων και κόστους για μοριακή διάγνωση κατά τη διάρκεια εστιών ασθενειών.Η παγκόσμια εξάπλωση της νόσου του κορωνοϊού 2019 (COVID-19) προκαλείται από το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2), επομένως η σημασία των μικρορευστών για την έγκαιρη πρόληψη και έλεγχο της πανδημίας τονίζεται ξανά [11, 12 , 13].Σε αντίθεση με τα παραδοσιακά διαγνωστικά, το microfluidic POCT χρησιμοποιεί μικρές φορητές συσκευές που κυμαίνονται από αναλυτές πάγκου έως μικρές πλευρικές δοκιμαστικές ταινίες για δοκιμή κοντά στο σημείο δειγματοληψίας [14].Αυτές οι δοκιμές διαθέτουν απλοϊκή ή καθόλου προετοιμασία δείγματος, γρήγορη ενίσχυση σήματος και ευαίσθητες μετρήσεις σήματος που έχουν ως αποτέλεσμα σύντομη διάρκεια και ακριβή αποτελέσματα μέσα σε λίγα λεπτά.Η διαθεσιμότητα και η μαζική παραγωγή εργαλείων υγειονομικής περίθαλψης με βάση τα μικρορευστά έχουν επεκτείνει τις οικονομικά αποδοτικές και άμεσες διαγνωστικές εφαρμογές τους εκτός νοσοκομείου, κοντά στον ασθενή, ακόμη και στο σπίτι.
Μεταξύ των υφιστάμενων στρατηγικών για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών, η μοριακή διάγνωση είναι μία από τις πιο ευαίσθητες [15, 16].Επιπλέον, η μοριακή διάγνωση χρησιμοποιείται συχνά ως το χρυσό πρότυπο για τη συνεχή ανίχνευση του COVID-19, επιτρέποντας την άμεση ανίχνευση περιοχών RNA ή DNA ειδικών για τον ιό πριν από την έναρξη μιας ανοσολογικής απόκρισης [17, 18].Στην τρέχουσα ανασκόπηση, παρουσιάζουμε τις τελευταίες εξελίξεις στις μοριακές διαγνωστικές διαδικασίες που βασίζονται σε μικρορευστήματα για μολυσματικές ασθένειες, από ακαδημαϊκή προοπτική έως μελλοντικές βιομηχανικές προοπτικές (Εικ. 1).Θα ξεκινήσουμε με τρία βασικά βήματα στην ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος: προεπεξεργασία δείγματος στο τσιπ, ενίσχυση νουκλεϊκού οξέος και ανάγνωση σήματος.Στη συνέχεια, συγκρίναμε διαφορετικούς τύπους μικρορευστικών πλατφορμών με τη δομή και τη λειτουργία τους, δείχνοντας μοναδικά χαρακτηριστικά (δυνατά σημεία και αδυναμίες).Η ψηφιακή ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος συζητείται περαιτέρω και δίνεται ως παράδειγμα τεχνολογίας τρίτης γενιάς για τον απόλυτο ποσοτικό προσδιορισμό μορίων μολυσματικών παθογόνων.Επιπλέον, θα παρουσιαστούν αρκετές τυπικές και πιο πρόσφατες εμπορικές συσκευές POCT για να καταδειχθεί η τρέχουσα κατάσταση της αγοράς μικρορευστών POCT για μοριακά διαγνωστικά.Θα συζητήσουμε επίσης και θα εξηγήσουμε το όραμά μας για μελλοντικές εφαρμογές.
Οι μονάδες μικρορευστοποιημένων τσιπ για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων μπορούν να χωριστούν σε τρεις κατηγορίες (δειγματοληψία, αναγνώριση και σηματοδότηση) ανάλογα με τις λειτουργίες τους [19].Μεταξύ αυτών των μονάδων, η μονάδα δειγματοληψίας πραγματοποιεί κυρίως λύση δειγμάτων και εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος.Η μονάδα αισθητήρα ελέγχει κυρίως τη μετατροπή και την ενίσχυση των σημάτων νουκλεϊκού οξέος.Η μονάδα σηματοδότησης ανιχνεύει το σήμα που μετατρέπεται και υποβάλλεται σε επεξεργασία από τη μονάδα ανίχνευσης.Με βάση τη διαδικασία ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων σε ένα τσιπ, θα συνοψίσουμε τα διάφορα τσιπ που μπορούν να πραγματοποιήσουν τη λειτουργία «εισόδου και εξόδου».
Το πρώτο βήμα στην ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος είναι η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος, δηλαδή η απομόνωση του νουκλεϊκού οξέος στόχου από το αρχικό δείγμα.Η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος εκτελείται για τον καθαρισμό των νουκλεϊκών οξέων από άλλους μοριακούς ρυπαντές, τη διασφάλιση της ακεραιότητας της πρωτογενούς δομής των μορίων νουκλεϊκού οξέος και τη βελτιστοποίηση των αποτελεσμάτων.Η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος απαιτεί την απαραίτητη λύση δείγματος και δέσμευση νουκλεϊκού οξέος, η ποιότητα και η αποτελεσματικότητα των οποίων έχουν τεράστιο αντίκτυπο στα ερευνητικά και διαγνωστικά αποτελέσματα.Οποιεσδήποτε ανεπαίσθητες παρενέργειες κατά την εκχύλιση μπορεί να περιορίσουν την περαιτέρω ανίχνευση.Για παράδειγμα, οι μέθοδοι αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και ισοθερμικής ενίσχυσης βρόχου (LAMP) αναστέλλονται από ορισμένους υπολειμματικούς οργανικούς διαλύτες όπως η αιθανόλη και η ισοπροπανόλη σε αντιδραστήρια απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων [20].Η εκχύλιση υγρού-υγρού και η εκχύλιση στερεάς φάσης είναι οι πιο δημοφιλείς μέθοδοι για την απομόνωση νουκλεϊκών οξέων [21], ωστόσο, η εκχύλιση υγρού-υγρού σε ένα τσιπ είναι εξαιρετικά περιορισμένη, καθώς τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στην εκχύλιση υγρού-υγρού προκαλούν διάβρωση των περισσότερων μικρορευστών τσιπ .Εδώ, επισημαίνουμε τις μεθόδους εξαγωγής στερεάς φάσης που βασίζονται σε μικροσυστοιχίες και συγκρίνουμε τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά τους.
Το πυρίτιο είναι ένα υλικό υποστρώματος συμβατό με νουκλεϊκά οξέα λόγω της βιοσυμβατότητας, της σταθερότητας και της ευκολίας τροποποίησης του [22].Είναι σημαντικό, όταν τροποποιείται με πυρίτιο ή άλλα υλικά, αυτό το σύνθετο παρουσιάζει ιδιότητες να προσροφά αρνητικά φορτισμένα νουκλεϊκά οξέα υπό συνθήκες χαμηλού pH, υψηλού αλατιού ενώ εκλούεται με διαλύματα υψηλού pH και χαμηλού αλατιού.Με βάση αυτό το φαινόμενο, είναι δυνατός ο καθαρισμός του νουκλεϊκού οξέος.
Διάφορες μορφές υλικών με βάση το πυρίτιο έχουν χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος σε μικρορευστικά, όπως σφαιρίδια πυριτίου, σκόνες, φίλτρα μικροϊνών και μεμβράνες πυριτίας [23, 24, 25, 26].Ανάλογα με τις ιδιότητες του υλικού, τα υλικά με βάση το πυρίτιο μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μικροκυκλώματα με διαφορετικούς τρόπους.Για παράδειγμα, οι κόκκοι πυριτίου, οι σκόνες και τα εμπορικά νανοφίλτρα μπορούν απλά να τοποθετηθούν στους πόρους ή στα μικροκανάλια των μικρορευστών τσιπ και να βοηθήσουν στην εξαγωγή νουκλεϊκών οξέων από δείγματα [27, 28, 29].Οι επιφανειακά τροποποιημένες μεμβράνες διοξειδίου του πυριτίου μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τον γρήγορο καθαρισμό του DNA από παθογόνα με χαμηλό κόστος.Για παράδειγμα, οι Wang et al.[30] Συνδυάζοντας αντιδράσεις ενίσχυσης μετουσίωσης με ανταλλαγή αλυσίδων που προκαλείται από κυστίδια με μεμβράνες πυριτίας επικαλυμμένες με ολιγοσακχαρίτες χιτοζάνης, εισήχθη ένα ευέλικτο φορητό σύστημα που ανίχνευσε με επιτυχία 102-108 μονάδες σχηματισμού αποικιών.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., και η παρουσία του ιού ήταν εύκολα ορατή.Powell et al.[31] Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν μικροσυστοιχίες με βάση το πυρίτιο για την ανίχνευση του ιού της ηπατίτιδας C (HCV), του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV), του ιού Ζίκα και του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων και για αυτόματη διάδοση, στην οποία αναπτύχθηκε ένας ελικοειδής μικροαντιδραστήρας 1,3 μl για τη σύλληψη ιών RNA.και να εκτελέσετε επιτόπια ενίσχυση.Εκτός από αυτές τις μεθόδους, οι επιφανειακά τροποποιημένες μικροστήλες πυριτίου διαδραματίζουν επίσης βασικό ρόλο στην εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος, καθώς η γεωμετρία και οι ιδιότητες του τροποποιητικού υλικού αυξάνουν σημαντικά την απόδοση εκχύλισης.Οι Chen et al.[32] πρότεινε μια μικρορευστοποιημένη πλατφόρμα για την απομόνωση RNA χαμηλής συγκέντρωσης που βασίζεται σε μικροστήλες πυριτίου επικαλυμμένες με αμινοξέα.Αυτή η μικρορευστοποιητική συσκευή ενσωματώνει μια σειρά μικροκολονών 0,25 cm2 σε ένα υπόστρωμα πυριτίου για την επίτευξη υψηλότερης απόδοσης εξαγωγής μέσω σχεδιασμού υψηλής αναλογίας επιφάνειας προς όγκο.Το πλεονέκτημα αυτού του σχεδιασμού είναι ότι η μικρορευστοποιητική συσκευή μπορεί να επιτύχει έως και 95% απόδοση εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος.Αυτές οι στρατηγικές με βάση το πυρίτιο καταδεικνύουν την αξία της ταχείας απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων με χαμηλό κόστος.Σε συνδυασμό με μικρορευστοποιημένα τσιπ, οι στρατηγικές εξαγωγής με βάση το πυρίτιο μπορούν όχι μόνο να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων, αλλά και να διευκολύνουν τη σμίκρυνση και την ενσωμάτωση των αναλυτικών συσκευών [20].
Οι μέθοδοι μαγνητικού διαχωρισμού χρησιμοποιούν μαγνητικά σωματίδια για την απομόνωση νουκλεϊκών οξέων παρουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου.Τα κοινώς χρησιμοποιούμενα μαγνητικά σωματίδια περιλαμβάνουν μαγνητικά σωματίδια Fe3O4 ή γ-Fe2O3 επικαλυμμένα με πυρίτιο, αμινο και καρβοξυλικό [33,34,35,36].Το χαρακτηριστικό γνώρισμα των μαγνητικών σωματιδίων σε σύγκριση με τις μεθόδους SPE με βάση το πυρίτιο είναι η ευκολία χειρισμού και ελέγχου με εξωτερικούς μαγνήτες.
Χρησιμοποιώντας την ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση μεταξύ νουκλεϊκών οξέων και πυριτίου, υπό συνθήκες υψηλού αλατιού και χαμηλού pH, τα νουκλεϊκά οξέα απορροφώνται στην επιφάνεια των μαγνητικών σωματιδίων επικαλυμμένων με πυρίτιο, ενώ σε συνθήκες χαμηλού αλατιού και υψηλού pH, τα μόρια μπορούν να πλυθούν πάλι..Τα επικαλυμμένα με πυρίτιο μαγνητικά σφαιρίδια καθιστούν δυνατή την εξαγωγή DNA από δείγματα μεγάλου όγκου (400 μL) χρησιμοποιώντας μαγνητικά ελεγχόμενη κίνηση [37].Ως επίδειξη, οι Rodriguez-Mateos et al.[38] χρησιμοποίησε συντονιζόμενους μαγνήτες για τον έλεγχο της μεταφοράς μαγνητικών σφαιριδίων σε διαφορετικούς θαλάμους.Με βάση τα επικαλυμμένα με πυρίτιο μαγνητικά σωματίδια, μπορούν να εξαχθούν 470 αντίγραφα/mL γονιδιωματικού RNA του SARS-CoV-2 από δείγματα λυμάτων για ανίχνευση αντίστροφης μεταγραφής LAMP (RT-LAMP) και η απόκριση μπορεί να διαβαστεί εντός 1 ώρας.γυμνό μάτι (Εικ. 2α).
Συσκευές βασισμένες σε μαγνητικά και πορώδη υλικά.Εννοιολογικό διάγραμμα της μικρορευστοποιητικής συσκευής IFAST RT-LAMP για ανίχνευση RNA SARS-CoV-2 (προσαρμογή από [38]).β Φυγοκεντρική μικροσυσκευή για dSPE νουκλεϊκού οξέος στοματικού επιχρίσματος (προσαρμογή από [39]).c Ενσωματωμένος αυτοτροφοδοτούμενος συμπυκνωτής δειγμάτων χρησιμοποιώντας κάρτα FTA® (προσαρμοσμένη από το [50]).d Διηθητικό χαρτί Fusion 5 τροποποιημένο με χιτοζάνη (προσαρμοσμένο από [51]).SARS-CoV-2 σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊός 2, ισοθερμική ενίσχυση με τη μεσολάβηση βρόχου αντίστροφης μεταγραφής RT-LAMP, τεχνολογικοί συνεργάτες εύρεσης FTA, νουκλεϊκό οξύ NA
Τα θετικά φορτισμένα μαγνητικά σωματίδια είναι ιδανικά για τη σύνδεση της φωσφορικής ραχοκοκαλιάς ενός νουκλεϊκού οξέος.Σε μια ορισμένη συγκέντρωση άλατος, οι αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες νουκλεϊκών οξέων μπορούν να φορτιστούν θετικά στην επιφάνεια των μαγνητικών σύνθετων σωματιδίων.Ως εκ τούτου, αναπτύχθηκαν μαγνητικά νανοσωματίδια με τραχιά επιφάνεια και υψηλή πυκνότητα αμινομάδων για την εξαγωγή νουκλεϊκών οξέων.Μετά τον μαγνητικό διαχωρισμό και τον αποκλεισμό, τα μαγνητικά νανοσωματίδια και τα σύμπλοκα DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν απευθείας στην PCR, γεγονός που εξαλείφει την ανάγκη για πολύπλοκες και χρονοβόρες λειτουργίες καθαρισμού και έκλουσης [35].Μαγνητικά νανοσωματίδια επικαλυμμένα με αρνητικές καρβοξυλομάδες έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό νουκλεϊκών οξέων που έχουν προσροφηθεί σε επιφάνειες σε διαλύματα πολυαιθυλενογλυκόλης και χλωριούχου νατρίου υψηλής συγκέντρωσης [36].Με αυτά τα επιφανειακά τροποποιημένα μαγνητικά σφαιρίδια, η εξαγωγή DNA είναι συμβατή με επακόλουθη ενίσχυση.Οι Dignan et al.[39] περιέγραψε μια αυτοματοποιημένη και φορητή φυγόκεντρη μικρορευστική πλατφόρμα για προεπεξεργασία νουκλεϊκού οξέος, επιτρέποντας σε μη τεχνικό προσωπικό να τη χρησιμοποιήσει επί τόπου.Επιπλέον, η συμβατότητα του απομονωθέντος DNA με το LAMP, μια μέθοδος κατάλληλη για ανάλυση νουκλεϊκού οξέος στο σημείο της φροντίδας, καταδεικνύει περαιτέρω ελάχιστες απαιτήσεις εξοπλισμού και καταλληλότητα για χρωματομετρικούς προσδιορισμούς (Εικ. 2β).
Οι μέθοδοι μαγνητικών σφαιριδίων προσφέρουν τη δυνατότητα αυτοματοποιημένης εκχύλισης, μερικές από τις οποίες υπάρχουν σε εμπορικούς αυτοματοποιημένους εκχυλιστές νουκλεϊκών οξέων [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, ΗΠΑ), QIAcube® HT;CapitalBio (Πεκίνο, Κίνα) και Biomek®.Μπέκμαν (Μαϊάμι, ΗΠΑ).), Φλόριντα, ΗΠΑ)].Τα πλεονεκτήματα του συνδυασμού μαγνητικών σφαιριδίων με μικρορευστικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αποτελεσματική αυτοματοποιημένη εξαγωγή νουκλεϊκών οξέων, η οποία θα μπορούσε ενδεχομένως να προωθήσει την ανάπτυξη μοριακής διάγνωσης.Ωστόσο, ο συνδυασμός μαγνητικών σφαιριδίων με μικρορευστικά εξακολουθεί να βασίζεται σε πολύπλοκα συστήματα ελέγχου για τον ακριβή χειρισμό των μαγνητικών σφαιριδίων, γεγονός που εξηγεί τη δημοτικότητα των εμπορικών προϊόντων να είναι ογκώδη και ακριβά, γεγονός που περιορίζει την περαιτέρω εφαρμογή μαγνητικών σφαιριδίων στο POCT.
Πολλά πορώδη υλικά όπως τροποποιημένα φίλτρα νιτροκυτταρίνης, κάρτες Finders Technology Associates (FTA), φίλτρα με βάση την πολυαιθεροσουλφόνη και υλικά επικαλυμμένα με γλυκάνη έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων [40, 41, 42, 43, 44].Τα πορώδη ινώδη υλικά όπως το ινώδες χαρτί χρησιμοποιήθηκαν για πρώτη φορά για την απομόνωση του DNA εμπλέκοντας φυσικά μακρόκλωνα μόρια DNA με ίνες.Οι μικροί πόροι οδηγούν σε ισχυρό φυσικό περιορισμό των μορίων DNA, ο οποίος επηρεάζει θετικά την εξαγωγή του DNA.Λόγω των διαφορετικών μεγεθών πόρων του ινώδους χαρτιού, η απόδοση εξαγωγής δεν μπορεί να καλύψει τις ανάγκες ενίσχυσης του DNA [45, 46].Η κάρτα FTA είναι ένα εμπορικό διηθητικό χαρτί που χρησιμοποιείται στον τομέα της ιατροδικαστικής και χρησιμοποιείται ευρέως σε άλλους τομείς της μοριακής διάγνωσης.Μέσω της χρήσης διηθητικού χαρτιού κυτταρίνης εμποτισμένου με διάφορες χημικές ουσίες για τη λύση των κυτταρικών μεμβρανών στο δείγμα, το DNA που απελευθερώνεται προστατεύεται από την αποικοδόμηση για έως και 2 χρόνια.Πιο πρόσφατα, εμποτισμένο χαρτί κυτταρίνης αναπτύχθηκε για τη μοριακή ανίχνευση διαφόρων παθογόνων, συμπεριλαμβανομένων του SARS-CoV-2, της λεϊσμανίασης και της ελονοσίας [47,48,49].Ο HIV στο απομονωμένο πλάσμα λύεται απευθείας και το ιικό νουκλεϊκό οξύ εμπλουτίζεται στη μεμβράνη ροής FTA® που είναι ενσωματωμένη στον συμπυκνωτή, η οποία επιτρέπει την αποτελεσματική παραγωγή του νουκλεϊκού οξέος [50] (Εικ. 2γ).Το κύριο πρόβλημα με την ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος χρησιμοποιώντας κάρτες FTA είναι ότι χημικές ουσίες όπως η γουανιδίνη και η ισοπροπανόλη αναστέλλουν τις επακόλουθες αντιδράσεις ενίσχυσης.Για να λύσουμε αυτό το πρόβλημα, αναπτύξαμε φίλτρο χαρτί τροποποιημένο με χιτοζάνη Fusion 5, το οποίο συνδυάζει τα πλεονεκτήματα τόσο της φυσικής σύμπλεξης μορίων DNA και ινώδους διηθητικού χαρτιού, όσο και της ηλεκτροστατικής προσρόφησης DNA σε τροποποιημένες με χιτοζάνη ενώσεις για την επίτευξη εξαιρετικά αποτελεσματικής εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος ..ίνες φίλτρου [51] (Εικ. 2δ).Ομοίως, οι Zhu et al.[52] επέδειξε μια τροποποιημένη με χιτοζάνη μέθοδο PCR βασισμένη σε ένα in situ τριχοειδές μικρορευστικό σύστημα για ταχεία απομόνωση και ανίχνευση του RNA του ιού Ζίκα.Τα νουκλεϊκά οξέα μπορούν να προσροφηθούν/εκροφηθούν σε ένα μικτό λύμα/μέσο PCR, αντίστοιχα, με βάση την ιδιότητα ενεργοποίησης/απενεργοποίησης της χιτοζάνης.ενεργοποίηση και απενεργοποίηση», ανταποκρίνεται στο pH.
Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, αυτές οι στρατηγικές συνδυάζουν τα πλεονεκτήματα των διαφόρων υλικών στερεάς φάσης και αυξάνουν την αποτελεσματικότητα της εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος σε μικρορευστήματα.Σε πρακτικές εφαρμογές, η χρήση αυτών των υλικών σε μεγάλες ποσότητες είναι αντιοικονομική και η σωστή επιφανειακή επεξεργασία ή η επιφανειακή τροποποίηση κοινών υλικών με αυτά τα υλικά μπορεί επίσης να διατηρήσει τη λειτουργία τους.Ως εκ τούτου, πιστεύεται ότι η εφαρμογή αυτών των στρατηγικών μετά από μια πιλοτική μελέτη μπορεί να μειώσει το κόστος.
Η δοκιμή νουκλεϊκού οξέος σε πλατφόρμες μικρορευστών χρησιμοποιεί συχνά μικρούς όγκους δειγμάτων (< 100 μl), επομένως απαιτεί ενίσχυση των νουκλεϊκών οξέων στόχου με ειδικούς ανιχνευτές για μετατροπή σε σήμα που είναι βολικό για ανίχνευση κατάντη (οπτικό, ηλεκτρικό και μαγνητικό) [53, 54]. Η δοκιμή νουκλεϊκού οξέος σε πλατφόρμες μικρορευστών χρησιμοποιεί συχνά μικρούς όγκους δειγμάτων (< 100 μl), επομένως απαιτεί ενίσχυση των νουκλεϊκών οξέων στόχου με ειδικούς ανιχνευτές για μετατροπή σε σήμα που είναι βολικό για ανίχνευση κατάντη (οπτικό, ηλεκτρικό και μαγνητικό) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Κατά τη δοκιμή νουκλεϊκών οξέων σε μικρορευστικές πλατφόρμες, χρησιμοποιούνται συχνά μικροί όγκοι δειγμάτων (<100 μL), επομένως απαιτείται η ενίσχυση των νουκλεϊκών οξέων-στόχων με ειδικούς ανιχνευτές για τη μετατροπή τους σε σήμα κατάλληλο για μετέπειτα ανίχνευση (οπτικό, ηλεκτρικό και μαγνητικό). [53, 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 µl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Η ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων σε μικρορευστικές πλατφόρμες συνήθως χρησιμοποιεί μικρούς όγκους δειγμάτων (<100 μl), κάτι που απαιτεί ενίσχυση των νουκλεϊκών οξέων-στόχων με ειδικούς ανιχνευτές για τη μετατροπή τους σε σήματα για επακόλουθη ανίχνευση (οπτική, ηλεκτρική και μαγνητική) [53, 54] .Η ενίσχυση νουκλεϊκού οξέος στα μικρορευστικά μπορεί επίσης να επιταχύνει τις αντιδράσεις, να βελτιστοποιήσει τα όρια ανίχνευσης, να μειώσει τις απαιτήσεις δειγμάτων και να βελτιώσει την ακρίβεια ανίχνευσης [55, 56].Τα τελευταία χρόνια, με την πραγματοποίηση γρήγορης και ακριβούς ανίχνευσης, έχουν εφαρμοστεί διάφορες μέθοδοι ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων στη μικρορευστοποίηση, συμπεριλαμβανομένης της PCR και ορισμένων αντιδράσεων ισοθερμικής ενίσχυσης.Αυτή η ενότητα θα συνοψίσει τις μεθόδους για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων που βασίζονται σε μικρορευστικά συστήματα.
Η PCR είναι μια προσομοίωση της διαδικασίας αντιγραφής του DNA ενός οργανισμού, η θεωρία της οποίας περιγράφεται λεπτομερώς αλλού και δεν θα συζητηθεί εδώ.Η PCR μπορεί να ενισχύσει μια πολύ μικρή ποσότητα DNA/RNA στόχου με εκθετικό ρυθμό, καθιστώντας την PCR ένα ισχυρό εργαλείο για την ταχεία ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων.Τις τελευταίες δεκαετίες, πολλές φορητές μικρορευστικές συσκευές εξοπλισμένες με συστήματα θερμικού κύκλου PCR έχουν αναπτυχθεί για να ανταποκρίνονται στις ανάγκες της διάγνωσης στο σημείο της φροντίδας [57, 58].Η on-chip PCR μπορεί να χωριστεί σε τέσσερις τύπους (συμβατική, συνεχούς ροής, χωρική μεταγωγή και συναγωγή PCR) σύμφωνα με διαφορετικές μεθόδους ελέγχου θερμοκρασίας [59].Για παράδειγμα, οι Gee et al.[60] ανέπτυξαν μια μέθοδο άμεσης ανάστροφης μεταγραφής ποσοτικής PCR (RT-qPCR) στη δική τους μικρορευστοποιημένη πλατφόρμα για την πολυπλεξία ανίχνευσης των ιών SARS-CoV-2, της γρίπης Α και Β σε δείγματα επιχρίσματος λαιμού (Εικ. 3α) .Park et al.[61] κατασκεύασε ένα απλό τσιπ ανάλυσης παθογόνου ενσωματώνοντας PCR λεπτού φιλμ, ηλεκτρόδια και μια μικρορευστοποιημένη μονάδα βασισμένη σε πολυδιμεθυλσιλοξάνιο που λειτουργεί με δάχτυλο.Ωστόσο, και τα δύο έργα ενσωματώνουν τα κοινά μειονεκτήματα της συμβατικής PCR.Η PCR απαιτεί θερμική κυκλοποίηση, η οποία περιορίζει την περαιτέρω σμίκρυνση της συσκευής και τον μειωμένο χρόνο δοκιμής.
Η ανάπτυξη μικρορευστοποιημένης PCR με βάση συνεχούς ροής και διαστημικής μεταγωγής είναι κρίσιμη για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος.Χρησιμοποιώντας ένα μακρύ οφιοειδές κανάλι ή ένα σύντομο ευθύ κανάλι, η PCR συνεχούς ροής μπορεί να προσφέρει γρήγορη ενίσχυση με ενεργή κυκλοφορία αντιδραστηρίων σε τρεις ζώνες προθέρμανσης με αντλία εκτός τσιπ.Αυτή η λειτουργία αποφεύγει επιτυχώς τη φάση μετάβασης μεταξύ διαφορετικών θερμοκρασιών αντίδρασης και έτσι μειώνει σημαντικά τον χρόνο δοκιμής [62] (Εικ. 3β).Σε μια άλλη μελέτη των Jung et al.[63] πρότεινε έναν νέο περιστροφικό γενετικό αναλυτή PCR που συνδυάζει τα χαρακτηριστικά της PCR σταθερής και ροής για υπερταχεία και πολυπλεξία PCR αντίστροφης μεταγραφής (Εικ. 3γ).Για την ενίσχυση νουκλεϊκού οξέος, το μικροτσίπ PCR θα περιστραφεί μέσω τριών μπλοκ θέρμανσης σε διαφορετικές θερμοκρασίες: 1. Μπλοκ μετουσίωσης 94°C, 2. Μπλοκ ανόπτησης στους 58°C, 3. Μπλοκ διαστολής στους 72°C.
Εφαρμογή της PCR στη μικρορευστοποίηση.Σχηματική αναπαράσταση του dirRT-qPCR σε μια μικρορευστοποιημένη πλατφόρμα (προσαρμογή από [60]).β Σχηματική αναπαράσταση μιας μικροσυστοιχίας PCR συνεχούς ροής που βασίζεται σε οφιοειδή κανάλι (προσαρμογή από [62]).γ Σχηματική αναπαράσταση ενός περιστροφικού γενετικού αναλυτή PCR, που αποτελείται από ένα μικροτσίπ, τρία θερμαντικά μπλοκ και έναν βηματικό κινητήρα (προσαρμοσμένο από το [63]).d Διάγραμμα θερμοαγωγικής PCR με φυγοκέντρηση και ρύθμιση (προσαρμογή από [64]).DirRT-qPCR, άμεση ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής
Χρησιμοποιώντας τριχοειδή αγγεία και βρόχους ή ακόμα και λεπτές πλάκες, η PCR συναγωγής μπορεί να ενισχύσει γρήγορα τα νουκλεϊκά οξέα με φυσική ελεύθερη θερμική μεταφορά χωρίς την ανάγκη εξωτερικής αντλίας.Για παράδειγμα, αναπτύχθηκε μια μικρορευστική πλατφόρμα κυκλικού πολυμερούς ολεφίνης σε ένα κατασκευασμένο περιστρεφόμενο στάδιο θέρμανσης που χρησιμοποιεί θερμικό κύκλο με φυγοκέντρηση σε ένα μικροκανάλι βρόχου PCR [64] (Εικ. 3δ).Το διάλυμα αντίδρασης οδηγείται από θερμική μεταφορά, η οποία ανταλλάσσει συνεχώς υψηλή και χαμηλή θερμοκρασία σε ένα μικροκανάλι με δακτυλιοειδή δομή.Ολόκληρη η διαδικασία ενίσχυσης μπορεί να ολοκληρωθεί σε 10 λεπτά με όριο ανίχνευσης 70,5 pg/κανάλι.
Όπως ήταν αναμενόμενο, η ταχεία PCR είναι ένα ισχυρό εργαλείο για πλήρως ενσωματωμένα συστήματα μοριακής διάγνωσης και πολυπλεξικής ανάλυσης δείγματος-απόκρισης.Η ταχεία PCR μειώνει σημαντικά τον χρόνο που απαιτείται για την ανίχνευση του SARS-CoV-2, ο οποίος συμβάλλει στον αποτελεσματικό έλεγχο της πανδημίας COVID-19.
Η PCR απαιτεί έναν πολύπλοκο θερμικό κυκλωτή που δεν είναι κατάλληλος για POCT.Πιο πρόσφατα, τεχνικές ισοθερμικής ενίσχυσης έχουν εφαρμοστεί στα μικρορευστικά, συμπεριλαμβανομένων, ενδεικτικά, της LAMP, της ενίσχυσης πολυμεράσης με ανασυνδυασμό (RPA) και της ενίσχυσης που βασίζεται σε αλληλουχίες νουκλεϊκών οξέων [65,66,67,68].Με αυτές τις τεχνικές, τα νουκλεϊκά οξέα ενισχύονται σε σταθερή θερμοκρασία, διευκολύνοντας τη δημιουργία φορητών συσκευών POCT χαμηλού κόστους, υψηλής ευαισθησίας για μοριακή διάγνωση.
Οι αναλύσεις LAMP που βασίζονται σε μικρορευστήματα υψηλής απόδοσης επιτρέπουν πολλαπλή ανίχνευση μολυσματικών ασθενειών [42, 69, 70, 71].Σε συνδυασμό με ένα φυγοκεντρικό μικρορευστο σύστημα, το LAMP μπορεί να διευκολύνει περαιτέρω την αυτοματοποίηση της ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων [69, 72, 73, 74, 75].Το spin-and-react SlipChip αναπτύχθηκε για την οπτική ανίχνευση πολλαπλών παράλληλων βακτηρίων χρησιμοποιώντας LAMP [76] (Εικ. 4α).Όταν χρησιμοποιήθηκε βελτιστοποιημένη LAMP στη δοκιμασία, η αναλογία σήματος φθορισμού προς θόρυβο ήταν περίπου 5 φορές και το όριο ανίχνευσης έφτασε τα 7,2 αντίγραφα/μl γονιδιωματικού DNA. Επιπλέον, η ύπαρξη πέντε κοινών πεπτικών βακτηριακών παθογόνων, συμπεριλαμβανομένων των Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis και Vibrio parahaemolyticus, οπτικοποιήθηκαν με βάση τη μέθοδο σε <60 λεπτά. Επιπλέον, η ύπαρξη πέντε κοινών πεπτικών βακτηριακών παθογόνων, συμπεριλαμβανομένων των Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis και Vibrio parahaemolyticus, οπτικοποιήθηκαν με βάση τη μέθοδο σε <60 λεπτά.Επιπλέον, η παρουσία πέντε κοινών βακτηριακών παθογόνων του πεπτικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis και Vibrio parahaemolyticus, οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο σε λιγότερο από 60 λεπτά.此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPΕπιπλέον, η παρουσία πέντε κοινών βακτηριακών γαστρεντερικών παθογόνων, συμπεριλαμβανομένων των Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius και Vibrio parahaemolyticus, οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο σε λιγότερο από 60 λεπτά.
Τα πλεονεκτήματα του LAMP στα μικρορευστικά περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, τη γρήγορη απόκριση και τη μικρογραφία ανίχνευσης.Ωστόσο, λόγω της θερμοκρασίας της αντίδρασης (περίπου 70°C), τα αερολύματα δημιουργούνται αναπόφευκτα κατά τη διάρκεια της LAMP, με αποτέλεσμα υψηλό ψευδώς θετικό ρυθμό.Η εξειδίκευση της ανάλυσης, ο σχεδιασμός του ασταριού και ο έλεγχος θερμοκρασίας πρέπει επίσης να βελτιστοποιηθούν για το LAMP.Επιπλέον, τα σχέδια τσιπ που υλοποιούν ανίχνευση πολλαπλών στόχων σε ένα μόνο τσιπ έχουν μεγάλη αξία και πρέπει να αναπτυχθούν.Επιπλέον, το LAMP είναι κατάλληλο για ανίχνευση πολλαπλών χρήσεων ενσωματωμένο σε ένα τσιπ, το οποίο έχει μεγάλη σημασία, αλλά υπάρχει ακόμα πολύς χώρος για ανάπτυξη.
Ο υψηλός ψευδώς θετικός ρυθμός του LAMP μπορεί να μειωθεί εν μέρει με το RPA, καθώς η σχετικά χαμηλή θερμοκρασία αντίδρασης (~37 °C) οδηγεί σε σχετικά λίγα προβλήματα εξάτμισης [77].Στο σύστημα RPA, δύο αντίθετοι εκκινητές εκκινούν τη σύνθεση DNA με σύνδεση σε μια ανασυνδυάση και η ενίσχυση μπορεί να ολοκληρωθεί εντός 10 λεπτών [78,79,80,81].Επομένως, όλη η διαδικασία RPA είναι πολύ πιο γρήγορη από την PCR ή τη LAMP.Τα τελευταία χρόνια, η τεχνολογία μικρορευστών έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει περαιτέρω την ταχύτητα και την ακρίβεια του RPA [82,83,84].Για παράδειγμα, οι Liu et al.[85] ανέπτυξε μια μικρορευστοποιημένη ενσωματωμένη ανάλυση ανασυνδυασμού πολυμεράσης πλευρικής ροής για ταχεία και ευαίσθητη ανίχνευση του SARS-CoV-2 ενσωματώνοντας RPA αντίστροφης μεταγραφής (RT-RPA) και ένα καθολικό σύστημα ανίχνευσης δοκιμαστικής ταινίας πλευρικής ροής.σε ένα ενιαίο μικρορευστο σύστημα.Εικόνα 4β).Το όριο ανίχνευσης είναι 1 αντίγραφο/µl ή 30 αντίγραφα/δείγμα και η ανίχνευση μπορεί να ολοκληρωθεί σε περίπου 30 λεπτά.Οι Kong et al.έχουν αναπτύξει μια φορητή συσκευή μικρορευστοποίησης.[86] χρησιμοποίησε τη θερμοκρασία του σώματος και ένα σύστημα ανίχνευσης φθορισμού βασισμένο σε κινητό τηλέφωνο για την ταχεία και άμεση ανίχνευση DNA του HIV-1 χρησιμοποιώντας RPA (Εικόνα 4γ).Ο φορητός προσδιορισμός RPA ανιχνεύει 100 αντίγραφα/mL της αλληλουχίας στόχου εντός 24 λεπτών, αποδεικνύοντας μεγάλες δυνατότητες για ταχεία διάγνωση βρεφών που έχουν μολυνθεί από τον HIV-1 σε ρυθμίσεις περιορισμένων πόρων.
Ισοθερμική ενίσχυση στη δοκιμή σημείου φροντίδας (POCT).Ανάπτυξη και παραγωγή σπιν και αντίδρασης SlipChip.Μετά τη συγκόλληση με πλάσμα, τα πάνω και κάτω τσιπ συναρμολογήθηκαν με ένα σετ παξιμαδιών για να σχηματίσουν το τελικό τσιπ (προσαρμοσμένο από το [76]).β Σχηματική απεικόνιση του συστήματος MI-IF-RPA για την ανίχνευση του COVID-19 (προσαρμογή από [85]).γ Σχηματικό τεστ RPA που μπορεί να φορεθεί για ταχεία ανίχνευση DNA του HIV-1 (προσαρμογή από [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM καρβοξυφθοροσκεΐνη, ιός ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας HIV, ενίσχυση πολυμεράσης ανασυνδυάσης RPA, δίοδος εκπομπής φωτός LED, MI-IFR Integrated MI-IF-Fluorescein Ενίσχυση
Το RPA που βασίζεται σε μικρορευστήματα αναπτύσσεται γρήγορα, ωστόσο, το κόστος κατασκευής τσιπ και η κατανάλωση αντίδρασης είναι πολύ υψηλό και πρέπει να μειωθεί για να αυξηθεί η διαθεσιμότητα αυτής της τεχνολογίας.Επιπλέον, η υψηλή ευαισθησία του RPA μπορεί να επηρεάσει την ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων, ειδικά σε περίπτωση μόλυνσης.Αυτοί οι περιορισμοί ενδέχεται να επηρεάσουν την εφαρμογή του RPA σε μικρορευστικά συστήματα και να αξίζουν περαιτέρω βελτιστοποίηση.Καλά σχεδιασμένοι εκκινητές και ανιχνευτές για διάφορους στόχους χρειάζονται επίσης για να βελτιωθεί η σκοπιμότητα των στρατηγικών μικρορευστών που βασίζονται σε RPA στο POCT.
Τα Cas13 και Cas12a έχουν την ικανότητα να διασπούν τυχαία τα νουκλεϊκά οξέα και έτσι μπορούν να αναπτυχθούν ως εργαλεία ανίχνευσης και διάγνωσης.Τα Cas13 και Cas12a ενεργοποιούνται κατά τη δέσμευση στο DNA-στόχο ή στο RNA, αντίστοιχα.Μόλις ενεργοποιηθεί, η πρωτεΐνη αρχίζει να διασπά άλλα κοντινά νουκλεϊκά οξέα, μετά τα οποία τα καθοδηγητικά RNA που στοχεύουν ειδικά για παθογόνα νουκλεϊκά οξέα μπορούν να διασπάσουν τους σβησμένους ανιχνευτές φθορισμού και να απελευθερώσουν φθορισμό.Με βάση αυτή τη θεωρία, οι Kellner et al.[87] ανέπτυξε μια μέθοδο βασισμένη στο Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking (SHERLOCK)] και οι Broughton et al.[88] ανέπτυξε μια άλλη προσέγγιση βασισμένη στο Cas12a [CRISPR Trans Reporter που στοχεύει την ενδονουκλεάση DNA (DTECR)].
Τα τελευταία χρόνια έχουν εμφανιστεί διάφορες μέθοδοι για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων με βάση το CRISPR [89, 90].Οι συμβατικές μέθοδοι που βασίζονται στο CRISPR είναι συχνά χρονοβόρες και απαιτητικές λόγω πολλαπλών διαδικασιών, όπως η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος, η ενίσχυση και η ανίχνευση CRISPR.Η έκθεση υγρών στον αέρα μπορεί να αυξήσει την πιθανότητα ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.Δεδομένων των παραπάνω, τα συστήματα που βασίζονται στο CRISPR έχουν απόλυτη ανάγκη βελτιστοποίησης.
Για εφαρμογές ανίχνευσης CRISPR-Cas12a και CRISPR-Cas13a αναπτύχθηκε μια πνευματικά ελεγχόμενη μικρορευστική πλατφόρμα που μπορεί να εκτελέσει 24 αναλύσεις παράλληλα [91].Το σύστημα είναι εξοπλισμένο με μια συσκευή ανίχνευσης φθορισμού που παρακάμπτει την ενίσχυση νουκλεϊκού οξέος και ανιχνεύει αυτόματα δείγματα γυρομοριακού DNA και RNA.Οι Chen et al.[92] ολοκληρωμένη ενίσχυση ανασυνδυασμού με το σύστημα CRISPR-Cas12a σε φυγόκεντρα μικρορευστήματα (Εικ. 5α).Αυτή η εργασία ξεπερνά τη δυσκολία ενσωμάτωσης αυτών των δύο διαδικασιών, επειδή το Cas12a μπορεί να αφομοιώσει το DNA του αγγελιοφόρου και να αναστείλει τη διαδικασία ενίσχυσης.Επιπλέον, οι Chen et al.[92] επιπροσθέτως προαποθήκευσε τα αντιδραστήρια της αντίδρασης σε φυγοκεντρικό μικρορευστικό έλεγχο για να ολοκληρωθεί αυτόματα ολόκληρη η διαδικασία.Σε άλλο έργο, οι Silva et al.[93] ανέπτυξε μια διαγνωστική μέθοδο χωρίς ενίσχυση CRISPR/Cas12a και ένα smartphone για τον εντοπισμό του SARS-CoV-2 (Εικ. 5β).Αυτή η ανάλυση, γνωστή ως σύστημα χωρίς ενίσχυση που βασίζεται σε κινητά τηλέφωνα, περιλαμβάνει ένα εξαρτώμενο από το CRISPR/Cas ένζυμο που βασίζεται στην οπτικοποίηση των σημάτων φυσαλίδων που παράγονται από την καταλάση σε μικρορευστικά κανάλια μέσω smartphone.Ευαίσθητη ανίχνευση λιγότερων από 50 αντιγράφων/μl νουκλεϊκού οξέος χωρίς προενίσχυση, η όλη διαδικασία από την έγχυση δείγματος έως την ανάγνωση του σήματος διαρκεί μόνο 71 λεπτά.
Μέθοδοι ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων με βάση το CRISPR.Φυγοκεντρικό POCT για ολοκληρωμένη μοριακή διάγνωση με βάση το CRISPR (προσαρμογή από [92]).β Ανάπτυξη του τεστ CASCADE για ανάλυση του SARS-CoV-2 που βασίζεται σε smartphone (προσαρμογή από [93]).Ενίσχυση RAA recombinase, μοτίβο γειτονικού πρωτοδιαστήματος PAM, CRISPR ομαδοποιημένες σύντομες παλινδρομικές επαναλήψεις σε τακτά χρονικά διαστήματα, σύστημα CASCADE χωρίς ενίσχυση κινητού τηλεφώνου με ένζυμα εξαρτώμενα από CRISPR/CAS, υδροχλωρίδιο 1-αιθυλ-3-[3-διμεθυλαμινοπροπυλ]καρβοδιιμίδιο EDC
Ως το τελευταίο βήμα στην ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος, η ανίχνευση σήματος αντανακλά άμεσα τα διαγνωστικά αποτελέσματα και είναι κρίσιμος παράγοντας για την ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού, ευαίσθητου και ακριβούς POCT.Τα σήματα μπορούν να διαβαστούν χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους όπως φθορίζουσες, ηλεκτροχημικές, χρωματομετρικές και μαγνητικές στρατηγικές.Σε αυτή την ενότητα, περιγράφουμε τη λογική για κάθε προσέγγιση και συγκρίνουμε τη μοριακή διάγνωση μολυσματικών ασθενειών στη μικρορευστοποίηση.
Οι στρατηγικές που βασίζονται στον φθορισμό χρησιμοποιούνται ευρέως για τη διάγνωση POCT μολυσματικών ασθενειών λόγω των αξιοσημείωτων πλεονεκτημάτων τους της εξαιρετικής ευαισθησίας, του χαμηλού κόστους, της ευκολίας λειτουργίας και της ανάλυσης στο σημείο φροντίδας [94, 95].Αυτές οι στρατηγικές χρησιμοποιούν επισημασμένα φθοροφόρα, όπως φθορίζουσες βαφές και νανοϋλικά για να δημιουργήσουν ένα ανιχνεύσιμο σήμα (βελτίωση φθορισμού ή απόσβεση).Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι οι στρατηγικές που βασίζονται στον φθορισμό μπορούν να χωριστούν σε άμεση σήμανση φθορισμού, ανίχνευση φθορισμού σήματος και απενεργοποίησης σήματος [96].Η άμεση ανίχνευση ετικετών φθορισμού χρησιμοποιεί ειδικές φθορίζουσες ετικέτες για την επισήμανση συγκεκριμένων συνδετών που παράγουν μια συγκεκριμένη ποσότητα φθορισμού όταν συνδέονται επιλεκτικά σε έναν στόχο.Για την ανίχνευση φθορισμού με βάση το σήμα, η ποιότητα του σήματος φθορισμού σχετίζεται θετικά με το μέγεθος του ενδιαφέροντος.Η ένταση του φθορισμού είναι αμελητέα απουσία στόχου και είναι ανιχνεύσιμη όταν υπάρχει επαρκής ποσότητα στόχου.Αντίστροφα, η ένταση του φθορισμού που ανιχνεύεται από τον φθορισμό «signal-off» είναι αντιστρόφως ανάλογη με την ποσότητα του στόχου, φθάνοντας αρχικά σε μια μέγιστη τιμή και σταδιακά μειώνεται καθώς ο στόχος μεγεθύνεται.Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας τον CRISPR-Cas13a εξαρτώμενο από στόχο μηχανισμό δια-διάσπασης, οι Tian et al.[97] ανέπτυξε μια νέα στρατηγική αναγνώρισης για την ανίχνευση RNA που παρακάμπτουν απευθείας την αντίστροφη μεταγραφή (Εικ. 6α).Κατά τη δέσμευση σε συμπληρωματικά RNA στόχους, το σύμπλεγμα CRISPR-Cas13-RNA μπορεί να ενεργοποιηθεί, προκαλώντας διαπαράπλευρη διάσπαση από μη ειδικά RNA αναφοράς.Ο σημασμένος με φθορισμό ανταποκριτής [φθοροφόρο (F)] σβήνεται από τον σβηστήρα (Q) ανέπαφο και φθορίζει όταν διασπάται από το ενεργοποιημένο σύμπλοκο.
Το πλεονέκτημα της ηλεκτροχημικής ανίχνευσης είναι η υψηλή ταχύτητα ανίχνευσης, η εύκολη παραγωγή, το χαμηλό κόστος, η εύκολη μεταφορά και ο αυτόματος έλεγχος.Είναι μια ισχυρή αναλυτική μέθοδος για εφαρμογές POCT.Με βάση τα τρανζίστορ φαινομένου γραφενίου Gao et al.[98] ανέπτυξε έναν νανοβιοαισθητήρα για την πολλαπλή ανίχνευση αντιγόνων της νόσου Lyme από βακτήρια Borrelia burgdorferi με όριο ανίχνευσης 2 pg/mL (Εικ. 6β).
Οι χρωματομετρικές δοκιμασίες έχουν χρησιμοποιηθεί σε εφαρμογές POCT, επωφελούμενοι από τα πλεονεκτήματα της φορητότητας, του χαμηλού κόστους, της ευκολίας προετοιμασίας και της οπτικής ανάγνωσης.Η χρωματομετρική ανίχνευση μπορεί να χρησιμοποιήσει την οξείδωση υπεροξειδάσης ή παρόμοιων με την υπεροξειδάση νανοϋλικών, τη συσσώρευση νανοϋλικών και την προσθήκη χρωστικών δεικτών για να μετατρέψει πληροφορίες σχετικά με την παρουσία νουκλεϊκών οξέων-στόχων σε ορατές χρωματικές αλλαγές [99, 100, 101].Συγκεκριμένα, τα νανοσωματίδια χρυσού χρησιμοποιούνται ευρέως στην ανάπτυξη χρωματομετρικών στρατηγικών και λόγω της ικανότητάς τους να προκαλούν γρήγορες και σημαντικές αλλαγές χρώματος, υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη χρωματομετρικών πλατφορμών POCT για in situ διάγνωση μολυσματικών ασθενειών [102].Με μια ενσωματωμένη φυγόκεντρη μικρορευστοποιητική συσκευή [103], τα τροφιμογενή παθογόνα σε μολυσμένα δείγματα γάλακτος μπορούν να ανιχνευθούν αυτόματα σε επίπεδο 10 βακτηριακών κυττάρων και τα αποτελέσματα μπορούν να διαβαστούν οπτικά μέσα σε 65 λεπτά (Εικ. 6γ).
Οι τεχνικές μαγνητικής ανίχνευσης μπορούν να ανιχνεύσουν με ακρίβεια τις αναλυόμενες ουσίες χρησιμοποιώντας μαγνητικά υλικά και υπάρχει σημαντικό ενδιαφέρον για τις εφαρμογές POCT τις τελευταίες δεκαετίες.Οι τεχνικές μαγνητικής ανίχνευσης έχουν μερικά μοναδικά πλεονεκτήματα όπως μαγνητικά υλικά χαμηλού κόστους παρά ακριβά οπτικά εξαρτήματα.Ωστόσο, η χρήση μαγνητικού πεδίου βελτιώνει την αποτελεσματικότητα ανίχνευσης και μειώνει τον χρόνο προετοιμασίας του δείγματος [104].Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μαγνητικής ανίχνευσης καταδεικνύουν υψηλή ειδικότητα, ευαισθησία και υψηλή αναλογία σήματος προς θόρυβο λόγω του ασήμαντου σήματος μαγνητικού υποβάθρου των βιολογικών δειγμάτων [105].Sharma et al.ενσωμάτωσε έναν βιοαισθητήρα με βάση τη διασταύρωση μαγνητικής σήραγγας σε μια φορητή πλατφόρμα μικροτσίπ.[106] για πολλαπλή ανίχνευση παθογόνων (Εικ. 6δ).Οι βιοαισθητήρες ανιχνεύουν με ευαισθησία υπονανομοριακά νουκλεϊκά οξέα που απομονώνονται από παθογόνα.
Τυπική μέθοδος ανίχνευσης σήματος.Η έννοια της υπερτοπικής ανίχνευσης του Cas13a (προσαρμοσμένη από το [97]).β Νανοβιοαισθητήρας FET γραφενίου σε συνδυασμό με Lyme GroES scFv (προσαρμογή από [98]).c Χρωματομετρικές ενδείξεις για την πολλαπλή ανίχνευση τροφιμογενών παθογόνων σε ένα φυγοκεντρικό μικρορευστικό τσιπ: Νο. 1 και Νο. 3 δείγματα με παθογόνα στόχους και Νο. 2, Νο. 4 και Νο. 5 δείγματα χωρίς παθογόνα στόχους (προσαρμογή από [103]) .δ Βιοαισθητήρας που βασίζεται σε μια διασταύρωση μαγνητικής σήραγγας, που περιλαμβάνει μια πλατφόρμα, έναν ενσωματωμένο ενισχυτή μπλοκαρίσματος, μια μονάδα ελέγχου και ένα τροφοδοτικό για παραγωγή/απόκτηση σήματος (προσαρμοσμένο από το [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA πολυμεθυλμεθακρυλικός
Παρά τα εξαιρετικά χαρακτηριστικά των παραπάνω μεθόδων ανίχνευσης, εξακολουθούν να έχουν μειονεκτήματα.Αυτές οι μέθοδοι συγκρίνονται (πίνακας 1), συμπεριλαμβανομένων ορισμένων εφαρμογών με λεπτομέρειες (πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα).
Με την ανάπτυξη της μικρορευστικότητας, των μικροηλεκτρομηχανικών συστημάτων, της νανοτεχνολογίας και της επιστήμης των υλικών, η χρήση μικρορευστοποιημένων τσιπ για την ανίχνευση μολυσματικών ασθενειών προχωρά συνεχώς [55,96,107,108].Ο ακριβής χειρισμός μικροσκοπικού εξοπλισμού και υγρών συμβάλλει στη διαγνωστική ακρίβεια και τη σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας.Ως εκ τούτου, για περαιτέρω ανάπτυξη, έχουν γίνει προσπάθειες για βελτιστοποίηση και αναβάθμιση των τσιπ, με αποτέλεσμα διάφορα μικρορευστοποιημένα τσιπ με διαφορετικές δομές και λειτουργίες.Εδώ παρουσιάζουμε εν συντομία αρκετούς κοινούς τύπους μικρορευστών πλατφορμών και συγκρίνουμε τα χαρακτηριστικά τους (πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα).Επιπλέον, τα περισσότερα από τα παραδείγματα που αναφέρονται παρακάτω επικεντρώνονται κυρίως στην καταπολέμηση του SARS-CoV-2.
Τα LOCC είναι τα πιο κοινά μικροσκοπικά σύνθετα αναλυτικά συστήματα και οι λειτουργίες τους είναι εξαιρετικά μικροσκοπικές, ολοκληρωμένες, αυτοματοποιημένες και παραλληλισμένες από την έγχυση και την προετοιμασία του δείγματος, τον έλεγχο ροής και την ανίχνευση υγρού [109, 110].Τα υγρά χειρίζονται μέσω της προσεκτικά σχεδιασμένης γεωμετρίας και της αλληλεπίδρασης πολλών φυσικών επιδράσεων όπως οι βαθμίδες πίεσης, η τριχοειδής δράση, η ηλεκτροδυναμική, τα μαγνητικά πεδία και τα ακουστικά κύματα [111].Το LOCC παρουσιάζει εξαιρετικά πλεονεκτήματα στον έλεγχο υψηλής απόδοσης και στην πολλαπλή ανίχνευση, με γρήγορη ταχύτητα ανάλυσης, μικρό μέγεθος δείγματος, χαμηλή κατανάλωση ενέργειας και υψηλή απόδοση διαχείρισης και λειτουργίας.Ωστόσο, οι συσκευές LOCC είναι πολύ ευαίσθητες και στην κατασκευή, τη συσκευασία και τη διασύνδεση.Ωστόσο, η πολυπλεξία και η επαναχρησιμοποίηση αντιμετωπίζουν τεράστιες δυσκολίες [96].Σε σύγκριση με άλλες πλατφόρμες, το LOCC έχει μοναδικά πλεονεκτήματα όσον αφορά τη μέγιστη ποικιλομορφία εφαρμογών και την καλύτερη συμβατότητα τεχνολογίας, αλλά τα μειονεκτήματά του είναι επίσης προφανή, δηλαδή υψηλή πολυπλοκότητα και κακή επαναληψιμότητα.Η εξάρτηση από εξωτερικές αντλίες, οι οποίες είναι συχνά ογκώδεις και ακριβές, περιορίζει περαιτέρω τη χρήση τους στο POCT.
Κατά τη διάρκεια της επιδημίας COVID-19, το LOCC έλαβε μεγάλη προσοχή.Ταυτόχρονα, υπάρχουν αρκετά νέα τσιπ που συνδυάζουν αρκετές τεχνολογίες.Για παράδειγμα, τα smartphone χρησιμοποιούνται πλέον ευρέως ως φορητές συσκευές ανάλυσης και έχουν μεγάλες δυνατότητες ενσωμάτωσης LOCC.Sun et al.[21] κατασκεύασε ένα μικρορευστο τσιπ που επιτρέπει την πολυπλεξία συγκεκριμένων αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων πέντε παθογόνων, συμπεριλαμβανομένου του SARS-CoV-2, χρησιμοποιώντας LAMP και τα ανέλυσε χρησιμοποιώντας ένα smartphone εντός 1 ώρας μετά το τέλος της αντίδρασης.Ως άλλο παράδειγμα, οι Sundah et al.[112] δημιούργησε έναν μοριακό διακόπτη [καταλυτική ενίσχυση με διακόπτη μοριακής μεταβατικής κατάστασης (CATCH)] για άμεση και ευαίσθητη ανίχνευση στόχων RNA SARS-CoV-2 χρησιμοποιώντας smartphone. Το CATCH είναι συμβατό με φορητό LOCC και επιτυγχάνει ανώτερη απόδοση (περίπου 8 αντίγραφα RNA/μl, < 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου) [112]. Το CATCH είναι συμβατό με φορητό LOCC και επιτυγχάνει ανώτερη απόδοση (περίπου 8 αντίγραφα RNA/μl, < 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου) [112]. CATCH μεвместим со портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (π.χ. 8 αντίγραφα РНК/мкл; < 1 ч при комнатной θερμοκρασία) [112]. Το CATCH είναι συμβατό με φορητό LOCC και παρέχει εξαιρετική απόδοση (περίπου 8 αντίγραφα RNA/μl, < 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时2） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时2） CATCH με вместим со портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (π.χ. 8 αντίγραφα РНК/мкл; < 1 часа при комнатной температура) [112]. Το CATCH είναι συμβατό με φορητά LOCC και έχει εξαιρετική απόδοση (περίπου 8 αντίγραφα RNA/μl, < 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου) [112].Επιπλέον, οι συσκευές LOCC για μοριακή διάγνωση χρησιμοποιούν επίσης ορισμένες κινητήριες δυνάμεις όπως το κενό, το τέντωμα και τα ηλεκτρικά πεδία.Οι Kang et al.[113] έδειξε μια εξαιρετικά γρήγορη PCR νανοπλάσματος σε πραγματικό χρόνο για ταχεία και ποσοτική διάγνωση του COVID-19 στο πεδίο χρησιμοποιώντας ένα τσιπ πλασμονικού υγρού PCR κενού.Οι Li et al.[114] στη συνέχεια ανέπτυξε ένα μικρορευστοποιημένο τσιπ που βασίζεται σε τέντωμα που επέτρεψε τη διάγνωση του COVID-19.Η πλατφόρμα χρησιμοποιεί το σύστημα ενίσχυσης RT-LAMP για να προσδιορίσει εάν ένα δείγμα είναι ποιοτικά θετικό ή αρνητικό.Στη συνέχεια, οι Ramachandran et al.[115] πέτυχε κατάλληλες διαβαθμίσεις ηλεκτρικού πεδίου χρησιμοποιώντας ισοταχοφόρηση (ITP), μια τεχνική επιλεκτικής εστίασης ιόντων που εφαρμόζεται στη μικρορευστοποίηση.Με το ITP, το RNA στόχου από ακατέργαστα δείγματα ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος μπορεί να καθαριστεί αυτόματα.Στη συνέχεια, οι Ramachandran et al.[115] Συνδυάζοντας αυτόν τον καθαρισμό ITP με αναλύσεις LAMP και CRISPR ενισχυμένες με ITP ανίχνευσαν τον SARS-CoV-2 σε ανθρώπινο ρινοφαρυγγικό επίχρισμα και κλινικά δείγματα σε περίπου 35 λεπτά.Επιπλέον, νέες ιδέες αναδύονται συνεχώς.Οι Jadhav et al.[116] πρότεινε ένα διαγνωστικό σχήμα βασισμένο σε φασματοσκοπία Raman ενισχυμένης επιφάνειας σε συνδυασμό με μια μικρορευστοποιημένη συσκευή που περιέχει είτε κατακόρυφα προσανατολισμένους νανοσωλήνες άνθρακα επικαλυμμένους με χρυσό/άργυρο είτε μικρο/νανοσωλήνες μίας χρήσης ηλεκτροϊνοποιημένους.Τα ενσωματωμένα μικροκανάλια φίλτρων που λειτουργούν με μεμβράνη είναι μιας χρήσης.Η συσκευή απορροφά ιούς από διάφορα σωματικά υγρά/εξιδρώματα όπως σάλιο, ρινοφάρυγγα και δάκρυα.Έτσι, ο τίτλος του ιού είναι άφθονος και ο ιός μπορεί να αναγνωριστεί με ακρίβεια από την υπογραφή Raman.
Το LOAD είναι μια φυγόκεντρη μικρορευστική πλατφόρμα στην οποία όλες οι διαδικασίες ελέγχονται από ένα πρωτόκολλο συχνότητας που περιστρέφει ένα μικροδομημένο υπόστρωμα [110].Η συσκευή LOAD χαρακτηρίζεται από τη χρήση φυγόκεντρης δύναμης ως σημαντική κινητήρια δύναμη.Τα υγρά υπόκεινται επίσης σε τριχοειδείς δυνάμεις, δυνάμεις Euler και Coriolis.Χρησιμοποιώντας μια συσκευή φυγοκέντρησης, οι αναλύσεις πραγματοποιούνται σε συνεχή λειτουργία υγρού από μια ακτινική προς τα μέσα προς τα έξω θέση, εξαλείφοντας την ανάγκη για πρόσθετους εξωτερικούς σωλήνες, αντλίες, ενεργοποιητές και ενεργές βαλβίδες.Εν ολίγοις, μια ενιαία μέθοδος ελέγχου απλοποιεί τη λειτουργία.Οι δυνάμεις που ασκούνται στο υγρό στο ίδιο μικρορευστικό κανάλι στην ίδια απόσταση από το κέντρο φορτίου είναι ίσες, γεγονός που καθιστά δυνατή την επανάληψη της δομής του καναλιού.Έτσι, ο εξοπλισμός LOAD είναι απλούστερος και πιο οικονομικός στη σχεδίαση και την κατασκευή από τον συμβατικό εξοπλισμό LOCC, ενώ οι αντιδράσεις είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητες και παραλληλισμένες.Ωστόσο, λόγω της υψηλής μηχανικής αντοχής του φυγοκεντρικού εξοπλισμού, το διαθέσιμο υλικό τσιπ είναι περιορισμένο και οι μικροί όγκοι είναι δύσκολοι.στο αυτοκίνητο.Ταυτόχρονα, οι περισσότερες συσκευές LOAD έχουν σχεδιαστεί μόνο για μία χρήση, κάτι που είναι ακριβό για ανίχνευση μεγάλης κλίμακας [96, 117, 118, 119].
Τις τελευταίες δεκαετίες, το LOAD, που θεωρείται μία από τις πιο υποσχόμενες μικρορευστοποιητικές συσκευές, έχει λάβει μεγάλη προσοχή από ερευνητές και κατασκευαστές.Έτσι, το LOAD έχει κερδίσει ευρεία αποδοχή και έχει χρησιμοποιηθεί για μοριακή διάγνωση μολυσματικών παθογόνων [120, 121, 122, 123, 124], ειδικά κατά τη διάρκεια της επιδημίας COVID-19.Για παράδειγμα, στα τέλη του 2020, οι Ji et al.[60] έδειξε μια άμεση ανάλυση RT-qPCR για ταχεία και αυτοματοποιημένη παράλληλη ανίχνευση λοιμώξεων SARS-CoV-2 και γρίπης Α και Β σε δείγματα επιχρίσματος λαιμού.Στη συνέχεια, οι Xiong et al.[74] παρουσίασε μια δισκοειδή μικρορευστική πλατφόρμα ενσωματωμένη σε LAMP για γρήγορη, ακριβή και ταυτόχρονη ανίχνευση επτά ανθρώπινων αναπνευστικών κορωνοϊών, συμπεριλαμβανομένου του SARS-CoV-2, μέσα σε 40 λεπτά.Στις αρχές του 2021, οι de Oliveira et al.[73] παρουσίασε ένα φυγοκεντρικό μικρορευστικό τσιπ τόνερ πολυστυρενίου, που λειτουργεί χειροκίνητα με περιστροφικό άκρο δακτύλου, για μοριακή διάγνωση RT-LAMP του COVID-19.Στη συνέχεια, οι Dignan et al.[39] παρουσίασε μια αυτοματοποιημένη φορητή μικροσυσκευή φυγοκέντρησης για τον καθαρισμό του RNA του SARS-CoV-2 απευθείας από τομές στοματικού επιχρίσματος.Medved et al.[53] πρότεινε ένα ενσωματωμένο σύστημα δειγματοληψίας αερολύματος SARS-CoV-2 με περιστρεφόμενο μικρορευστο φθορίζον τσιπ μικρού όγκου με όριο ανίχνευσης 10 αντίγραφα/μL και ελάχιστο όριο κύκλου 15 λεπτών.Οι Suarez et al.[75] ανέφερε πρόσφατα την ανάπτυξη μιας ολοκληρωμένης αρθρωτής φυγοκεντρικής μικρορευστικής πλατφόρμας για την άμεση ανίχνευση του RNA του SARS-CoV-2 σε δείγματα ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος απενεργοποιημένα με θερμότητα χρησιμοποιώντας LAMP.Αυτά τα παραδείγματα καταδεικνύουν τα μεγάλα οφέλη και την υπόσχεση του LOAD στη μοριακή διάγνωση του COVID-19.
Το 1945 οι Muller και Clegg [125] παρουσίασαν για πρώτη φορά μικρορευστοποιητικά κανάλια σε χαρτί χρησιμοποιώντας διηθητικό χαρτί και παραφίνη.Το 2007, η ομάδα Whitesides [126] δημιούργησε την πρώτη λειτουργική πλατφόρμα χαρτιού για δοκιμές πρωτεΐνης και γλυκόζης.Το χαρτί έχει γίνει ιδανικό υπόστρωμα για μικρορευστήματα.Το χαρτί έχει εγγενείς ιδιότητες όπως υδροφιλία και πορώδη δομή, εξαιρετική βιοσυμβατότητα, μικρό βάρος, ευελιξία, δυνατότητα αναδίπλωσης, χαμηλό κόστος, ευκολία στη χρήση και ευκολία.Τα κλασικά μPAD αποτελούνται από υδρόφιλες/υδρόφοβες δομές χτισμένες σε χάρτινα υποστρώματα.Ανάλογα με την τρισδιάστατη δομή, τα μPAD μπορούν να χωριστούν σε δισδιάστατα (2D) και τρισδιάστατα (3D) μPAD.Τα 2D μPAD παράγονται σχηματίζοντας υδρόφοβα όρια για να σχηματίσουν μικρορευστοποιήσιμα κανάλια, ενώ τα 3D μPAD κατασκευάζονται συνήθως από στοίβες στρώσεων 2D μικρορευστού χαρτιού, μερικές φορές με δίπλωμα χαρτιού, τεχνικές ολίσθησης, ανοιχτά κανάλια και τρισδιάστατη εκτύπωση [96].Τα υδατικά ή βιολογικά ρευστά στο μPAD ελέγχονται κυρίως από τριχοειδική δύναμη χωρίς εξωτερική πηγή ενέργειας, διευκολύνοντας την προ-αποθήκευση αντιδραστηρίων, το χειρισμό δειγμάτων και την ανίχνευση πολυπλεξίας.Ωστόσο, ο ακριβής έλεγχος ροής και η ανίχνευση πολυπλεξίας παρεμποδίζονται από την ανεπαρκή ταχύτητα ανίχνευσης, ευαισθησία και επαναχρησιμοποίηση [96, 127, 128, 129, 130].
Ως μια ασυνήθιστη μικρορευστική πλατφόρμα, το μPAD έχει προωθηθεί και αναπτυχθεί ευρέως για τη μοριακή διάγνωση μολυσματικών ασθενειών όπως ο HCV, ο HIV και ο SARS-CoV-2 [131, 132].Για την επιλεκτική και ευαίσθητη ανίχνευση του HCV, οι Tengam et al.[133] ανέπτυξε έναν νέο βιοαισθητήρα βασισμένο σε φθορίζον χαρτί χρησιμοποιώντας έναν εξαιρετικά ειδικό ανιχνευτή νουκλεϊκού οξέος που βασίζεται σε πυρρολιδινυλικό πεπτίδιο.Τα νουκλεϊκά οξέα ακινητοποιούνται ομοιοπολικά σε μερικώς οξειδωμένο χαρτί κυτταρίνης με αναγωγική αλκυλίωση μεταξύ αμινομάδων και ομάδων αλδεΰδης και η ανίχνευση βασίζεται στον φθορισμό.Αυτά τα σήματα μπορούν να διαβαστούν από ένα ειδικά κατασκευασμένο gadget με φορητή κάμερα φθορισμού σε συνδυασμό με κάμερα κινητού τηλεφώνου.Στη συνέχεια, οι Lu et al.[134] σχεδίασε ένα εύκαμπτο ηλεκτρόδιο με βάση το χαρτί που βασίζεται σε νανοσωματίδια νικελίου/χρυσού/νανοσωλήνες άνθρακα/πολυβινυλική αλκοόλη οργανομεταλλικού πλαισίου για την ανίχνευση στόχου HIV με υβριδισμό DNA χρησιμοποιώντας μπλε του μεθυλενίου ως δείκτη οξειδοαναγωγής του DNA.Πιο πρόσφατα, οι Chowdury et al.[135] παρουσίασε ένα υποθετικό σχέδιο πλατφόρμας για δοκιμή μPAD σημείου φροντίδας χρησιμοποιώντας ακατέργαστο σάλιο ασθενούς σε συνδυασμό με LAMP και φορητή τεχνολογία απεικόνισης για την ανίχνευση αναλυτών COVID-19.
Οι δοκιμές πλευρικής ροής καθοδηγούν τα υγρά με τριχοειδείς δυνάμεις και ελέγχουν την κίνηση του υγρού από τη διαβρεξιμότητα και τα χαρακτηριστικά των πορωδών ή μικροδομημένων υποστρωμάτων.Οι συσκευές πλευρικής ροής αποτελούνται από δείγμα, συζυγές, επωαστήρα και ανίχνευση και απορροφητικά επιθέματα.Τα μόρια νουκλεϊκού οξέος στο LFA αναγνωρίζουν συγκεκριμένα συνδετικά που είναι προαποθηκευμένα στη θέση δέσμευσης και δεσμεύονται ως σύμπλοκα.Καθώς το υγρό περνά μέσα από τις πλάκες επώασης και ανίχνευσης, τα σύμπλοκα συλλαμβάνονται από τα μόρια σύλληψης που βρίσκονται στις γραμμές δοκιμής και ελέγχου, δείχνοντας αποτελέσματα που μπορούν να διαβαστούν απευθείας με γυμνό μάτι.Συνήθως, το LFA μπορεί να ολοκληρωθεί σε 2-15 λεπτά, το οποίο είναι ταχύτερο από την παραδοσιακή ανακάλυψη.Λόγω του ειδικού μηχανισμού, το LFA απαιτεί λίγες λειτουργίες και δεν απαιτεί πρόσθετο εξοπλισμό, γεγονός που το καθιστά πολύ φιλικό προς το χρήστη.Είναι εύκολο να κατασκευαστεί και να μικρογραφία, και το κόστος των υποστρωμάτων με βάση το χαρτί είναι χαμηλότερο.Ωστόσο, χρησιμοποιείται μόνο για ποιοτική ανάλυση και η ποσοτική ανίχνευση είναι πολύ δύσκολη και η ικανότητα πολυπλεξίας και η απόδοση είναι πολύ περιορισμένες και μόνο ένα επαρκές νουκλεϊκό οξύ μπορεί να ανιχνευθεί κάθε φορά [96,110,127].
Αν και οι περισσότερες εφαρμογές του LFA εστιάζονται σε ανοσοπροσδιορισμούς, η χρήση του LFA για μοριακή διάγνωση σε μικρορευστοποιημένα τσιπ είναι επίσης αποτελεσματική και δημοφιλής [136].Στην περίπτωση του ιού της ηπατίτιδας Β, του HIV και του SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] πρότεινε μια πλατφόρμα LFA νανοσωματιδίων ανοδικής μετατροπής και απέδειξε την ευελιξία αυτής της μικροσκοπικής και φορητής πλατφόρμας μέσω της ευαίσθητης και ποσοτικής ανίχνευσης πολλαπλών στόχων όπως το νουκλεϊκό οξύ HBV.Επιπλέον, οι Fu et al.[138] έδειξε ένα νέο LFA που βασίζεται σε φασματοσκοπία Raman ενισχυμένης επιφάνειας για την ποσοτική ανάλυση του DNA του HIV-1 σε χαμηλές συγκεντρώσεις.Για την ταχεία και ευαίσθητη ανίχνευση του SARS-CoV-2, οι Liu et al.[85] ανέπτυξε μια ανάλυση πλευρικής ροής RPA ενσωματωμένη σε μικρορευστότητα συνδυάζοντας το RT-RPA και ένα καθολικό σύστημα ανίχνευσης πλευρικής ροής σε ένα ενιαίο μικρορευστικό σύστημα.
Η εφαρμογή διαφόρων πλατφορμών μικρορευστών ποικίλλει ανάλογα με τις συγκεκριμένες μελέτες, αξιοποιώντας πλήρως τις δυνατότητες και τα πλεονεκτήματα των πλατφορμών.Με προσιτές βαλβίδες, αντλίες και αγωγούς, το LOCC είναι η πιο ολοκληρωμένη πλατφόρμα για ποικιλία εφαρμογών και διαλειτουργικότητα με το μεγαλύτερο περιθώριο ανάπτυξης.Ως εκ τούτου, ελπίζουμε και προτείνουμε να γίνουν οι νεότερες μελέτες στο LOCC ως πρώτη προσπάθεια και να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες.Επιπλέον, αναμένεται να ανακαλυφθούν και να χρησιμοποιηθούν στο σύστημα πιο αποτελεσματικές και ακριβείς μέθοδοι.Το LOAD υπερέχει στον ακριβή έλεγχο των υγρών από τις υπάρχουσες συσκευές LOCC και επιδεικνύει μοναδικά πλεονεκτήματα σε μεμονωμένες μονάδες μετάδοσης κίνησης με φυγόκεντρη δύναμη χωρίς την ανάγκη εξωτερικών ηλεκτροκινητήρων, ενώ οι παράλληλες αποκρίσεις μπορούν να διαχωριστούν και να συγχρονιστούν.Έτσι, στο μέλλον, το LOAD θα γίνει η κύρια πλατφόρμα μικρορευστών με λιγότερες χειροκίνητες λειτουργίες και πιο ώριμες και αυτοματοποιημένες τεχνολογίες.Η πλατφόρμα μPAD συνδυάζει τα πλεονεκτήματα του LOCC και των υλικών με βάση το χαρτί για διαγνωστικά μιας χρήσης χαμηλού κόστους.Ως εκ τούτου, η μελλοντική ανάπτυξη θα πρέπει να επικεντρωθεί σε βολικές και καθιερωμένες τεχνολογίες.Επιπλέον, το LFA είναι κατάλληλο για ανίχνευση γυμνού οφθαλμού, υπόσχεται να μειώσει την κατανάλωση δείγματος και να επιταχύνει την ανίχνευση.Μια λεπτομερής σύγκριση πλατφόρμας φαίνεται στον Πίνακα 2.
Οι ψηφιακές αναλύσεις χωρίζουν το δείγμα σε πολλούς μικροαντιδραστήρες, καθένας από τους οποίους περιέχει έναν διακριτό αριθμό μορίων-στόχων [139, 140].Οι ψηφιακές αναλύσεις προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα για την εκτέλεση απόλυτης ποσοτικοποίησης εκτελώντας χιλιάδες παράλληλα βιοχημικά πειράματα ταυτόχρονα και μεμονωμένα σε διαμερίσματα κλίμακας micron και όχι σε συνεχή φάση.Σε σύγκριση με τα παραδοσιακά μικρορευστικά, οι αντιδράσεις διαμερίσματος μπορούν να μειώσουν τον όγκο του δείγματος, να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης και να ενσωματωθούν εύκολα με άλλες αναλυτικές μεθόδους χωρίς την ανάγκη για κανάλια, αντλίες, βαλβίδες και συμπαγή σχέδια [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Οι ακόλουθες δύο μέθοδοι χρησιμοποιούνται σε ψηφιακές αναλύσεις για την επίτευξη ομοιόμορφου και ακριβούς διαχωρισμού διαλυμάτων, συμπεριλαμβανομένων αντιδραστηρίων και δειγμάτων όπως κύτταρα, νουκλεϊκά οξέα και άλλα σωματίδια ή μόρια:(2) Η διαίρεση της διάταξης πραγματοποιείται από τους γεωμετρικούς περιορισμούς της συσκευής.Στην πρώτη μέθοδο, σταγονίδια που περιέχουν αντιδραστήρια και δείγματα σε μικροκανάλια μπορούν να δημιουργηθούν με παθητικές μεθόδους όπως συν-ρεύμα, εγκάρσια ροή, εστίαση ροής, σταδιακή γαλακτωματοποίηση, γαλακτωματοποίηση μικροκαναλιού και μεμβράνες μέσω ιξωδών δυνάμεων διάτμησης και γαλακτωματοποίησης με αλλαγή καναλιού.εντοπισμός [143, 145, 146, 148, 149] ή χρήση ενεργών μεθόδων [150, 151], οι οποίες εισάγουν πρόσθετη ενέργεια μέσω ηλεκτρικού, μαγνητικού, θερμικού και μηχανικού ελέγχου.Στην τελευταία προσέγγιση, η καλύτερη ομοιομορφία όγκου ρευστού στους μικρορευστικούς θαλάμους μοιράζεται διατηρώντας χωρικές δομές του ίδιου μεγέθους, όπως μικροκοίλους και επιφανειακές συστοιχίες [152,153,154].Συγκεκριμένα, τα σταγονίδια είναι κύρια τμήματα ροής που μπορούν επίσης να δημιουργηθούν και να χειριστούν σε συστοιχίες ηλεκτροδίων που βασίζονται σε ψηφιακά μικρορευστήματα (DMF).Η ηλεκτροδιαβροχή των διηλεκτρικών είναι μια από τις καλύτερα μελετημένες θεωρίες DMF, καθώς η ηλεκτροδιαβροχή των διηλεκτρικών επιτρέπει τον ακριβή χειρισμό μεμονωμένων σταγόνων, ελέγχοντας το σχήμα του υγρού και τα ασύμμετρα ηλεκτρικά σήματα που διέρχονται από διαφορετικές πλευρές [141, 144].Οι κύριες λειτουργίες με σταγονίδια στο DMF περιλαμβάνουν τη διαλογή, τη διάσπαση και τη συγχώνευση [151, 155, 156], οι οποίες μπορούν να εφαρμοστούν σε διάφορα πεδία ανάλυσης, ειδικά στη μοριακή ανίχνευση [157, 158, 159].
Η ψηφιακή ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος είναι μια μοριακή διαγνωστική τεχνολογία τρίτης γενιάς που ακολουθεί συμβατική PCR και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR), παράλληλα με προσδιορισμό αλληλουχίας υψηλής απόδοσης και υγρή βιοψία.Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, τα ψηφιακά νουκλεϊκά οξέα έχουν αναπτυχθεί γρήγορα στον τομέα της μοριακής διάγνωσης μολυσματικών παθογόνων [160, 161, 162].Ο απόλυτος ποσοτικός προσδιορισμός της ψηφιακής ανίχνευσης νουκλεϊκού οξέος ξεκινά με τη συσκευασία δειγμάτων και αντιδραστηρίων σε μεμονωμένα διαμερίσματα για να διασφαλιστεί ότι κάθε αλληλουχία στόχος έχει την ίδια πιθανότητα να εισέλθει σε κάθε μεμονωμένο διαμέρισμα.Θεωρητικά, σε κάθε τμήμα μπορεί να εκχωρηθούν πολλαπλές αλληλουχίες στόχου ή μπορεί να μην υπάρχει ανεξάρτητο σύστημα μικροαντίδρασης.Μέσω των διαφόρων μηχανισμών ανίχνευσης που περιγράφονται παραπάνω, διαμερίσματα με μικροβιακές αλληλουχίες στόχων που παράγουν σήματα πάνω από ένα ορισμένο όριο μπορούν να οραματιστούν με γυμνό μάτι ή από μηχανή και επισημαίνονται ως θετικά, ενώ άλλα διαμερίσματα που παράγουν σήματα κάτω από το όριο επισημαίνονται ως θετικά .αρνητικές, οι οποίες κάνουν το σήμα για κάθε τμήμα boolean.Έτσι, με τον υπολογισμό του αριθμού των διαμερισμάτων που δημιουργήθηκαν και του ρυθμού των θετικών αποτελεσμάτων μετά την αντίδραση, τα πρωτότυπα αντίγραφα των δειγμάτων δοκιμής μπορούν να αντιστοιχιστούν χρησιμοποιώντας τον τύπο κατανομής Poisson χωρίς να απαιτείται μια τυπική καμπύλη, η οποία απαιτείται για συνηθισμένες ποσοτικές αναλύσεις, όπως π. ως qPCR.[163] Σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους μοριακής διάγνωσης, η ψηφιακή ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος έχει υψηλότερο βαθμό αυτοματισμού, υψηλότερη ταχύτητα και ευαισθησία ανάλυσης, λιγότερα αντιδραστήρια, λιγότερη μόλυνση και απλούστερο σχεδιασμό και κατασκευή.Για αυτούς τους λόγους, η χρήση ψηφιακών αναλύσεων, ειδικά μεθόδων που βασίζονται σε σταγόνες, για μοριακή διάγνωση, που συνδυάζουν τεχνικές ενίσχυσης και ανάγνωσης σήματος, έχει μελετηθεί καλά κατά τη διάρκεια της κρίσιμης έκρηξης του SARS-CoV-2.Για παράδειγμα, οι Yin et al.[164] συνδύασε ψηφιακές μεθόδους σταγονιδίων και ταχεία PCR για την ανίχνευση των γονιδίων ORF1ab, N και RNase P στον SARS-CoV-2 σε ένα μικρορευστο τσιπ.Συγκεκριμένα, το σύστημα μπόρεσε να αναγνωρίσει ένα θετικό σήμα μέσα σε 115 δευτερόλεπτα, το οποίο είναι ταχύτερο από τη συμβατική PCR, υποδεικνύοντας την αποτελεσματικότητά του στην ανίχνευση σημείου φροντίδας (Εικόνα 7α).Οι Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] και Alteri et al.[167] εφάρμοσε επίσης σταγονοειδή ψηφιακή PCR (ddPCR) για την ανίχνευση του SARS-CoV-2 σε ένα μικρορευστο σύστημα με εντυπωσιακά αποτελέσματα.Για περαιτέρω βελτίωση του ρυθμού ανίχνευσης, οι Shen et al.[168] πέτυχε απεικόνιση τσιπ με βάση ddPCR σε μόλις 15 δευτερόλεπτα χωρίς τη χρήση τεχνικών συρραφής εικόνας, επιταχύνοντας τη διαδικασία της τεχνολογίας ddPCR από εργαστήριο σε εφαρμογή.Δεν εφαρμόζονται μόνο μέθοδοι θερμικής ενίσχυσης όπως η PCR, αλλά και μέθοδοι ισοθερμικής ενίσχυσης χρησιμοποιούνται για την απλοποίηση των συνθηκών αντίδρασης και της γρήγορης απόκρισης.Lu et al.[71] ανέπτυξε το SlipChip για ανάλυση σταγονιδίων, ικανό να δημιουργεί σταγονίδια διαφόρων μεγεθών σε υψηλές πυκνότητες σε ένα βήμα και να ποσοτικοποιεί τα νουκλεϊκά οξέα SARS-CoV-2 χρησιμοποιώντας ψηφιακό LAMP (Εικόνα 7β).Ως ταχέως εξελισσόμενη τεχνολογία, το CRISPR μπορεί επίσης να παίξει σημαντικό ρόλο στην ψηφιακή ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων μέσω βολικής χρωματομετρικής απεικόνισης χωρίς την ανάγκη πρόσθετων λεκέδων νουκλεϊκού οξέος.Οι Ackerman et al.ανέπτυξε μια συνδυαστική αντίδραση μήτρας για πολλαπλή αξιολόγηση νουκλεϊκών οξέων.[158] ανίχνευσε 169 ιούς που σχετίζονται με τον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένου του SARS-CoV-2, σε σταγονίδια που περιείχαν αντιδραστήρια ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων με βάση το CRISPR-Cas13 σε μια ανάλυση μικροϋπολογιστών (Εικόνα 7γ).Επιπλέον, η ισοθερμική ενίσχυση και η τεχνολογία CRISPR μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο ίδιο σύστημα για να συνδυάσουν τα οφέλη και των δύο.Park et al.[169] Ένας ψηφιακός προσδιορισμός CRISPR/Cas12a αναπτύχθηκε σε ένα εμπορικό μικρορευστικό τσιπ για την ανίχνευση του εξαγόμενου και εξουδετερωμένου από τη θερμότητα SARS-CoV-2 με βάση ένα RT-RPA ενός σταδίου με συντομότερη και υψηλότερη ανίχνευση σήματος προς φόντο αναλογία χρόνου., ευρύτερο δυναμικό εύρος και καλύτερη ευαισθησία (Εικ. 7δ).Ορισμένες περιγραφές αυτών των παραδειγμάτων δίνονται στον Πίνακα 3.
Τυπική ψηφιακή πλατφόρμα για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων.α Η ροή εργασιών ταχείας ψηφιακής PCR αποτελείται από τέσσερα βασικά βήματα: προετοιμασία δείγματος, διανομή του μείγματος αντίδρασης, διαδικασία ενίσχυσης και ποσοτικοποίηση στόχου (προσαρμοσμένη από το [164]).β Σχηματική ανάλυση των σταγονιδίων SlipChip για σχηματισμό σταγονιδίων σε υψηλή πυκνότητα (προσαρμογή από [71]).c Διάγραμμα ροής εργασίας CARMEN-Cas13 (προσαρμοσμένο από [158]).δ Επισκόπηση προηγμένης ψηφιακής ανίχνευσης ιών με CRISPR/Cas σε ένα δοχείο (προσαρμογή από [169]).W/O νερό σε λάδι, πολυδιμεθυλσιλοξάνιο PDMS, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR, συλλογή δεδομένων DAQ, αναλογικό ενιαίο παράγωγο PID, αντίδραση συνδυασμού μήτρας CARMEN για αξιολόγηση πολλαπλού νουκλεϊκού οξέος, SARS-CoV-2, σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο, κορωνοϊός 2, RT Ενίσχυση της αντίστροφης μεταγραφάσης ρεκομπινάσης πολυμεράσης-RPA, σήμα S/B στο παρασκήνιο